 |
Отрицательная и положительная суперспирализация. Ферменты топоизомеразы.
|
|
|
|
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
Лабораторный практикум
Вологда
2018
УДК
Молекулярная биология:лабораторный практикум / сост.: Д.М. Кривошеев. – Вологда: ВоГУ, 2018. – 57 с.
Лабораторный практикум подготовлен в соответствии с программой курса «Молекулярная биология» для студентов направления подготовки бакалавриата 20.03.01 «Биоэкология». Методическое пособие служит для выполнения лабораторных работ студентами всех форм бучения. Может быть использовано при текущей самопроверке изучаемого материала и при выполнении контрольных работ студентами заочной формы обучения.
Утверждено редакционно-издательским советом ВоГУ
Составители: Д.М. Кривошеев, канд. биол. наук.
Рецензент
ВВЕДЕНИЕ
Одним из важнейших достижений биологии XX века стало открытие структуры молекулы ДНК, которое позволило не только определить ключевую роль данного биополимера в хранении и реализации наследственной информации, но и использовать ДНК-технологии в практике различных направлений биотехнологий.Нуклеиновые кислоты были описаны в 1869 году И.Ф. Мишером, который выделил данные соединения из гноя и молок лососевых рыб. Термин «нуклеиновая кислота» был веден учеником Мишера Р. Альтманом. Интересно отметить, что данное открытие совпало по времени с работами Г. Менделя, позволившими выявить наличие единиц наследственности, и с безуспешными попытками Ч.Дарвина объяснить природу наследственной изменчивости. Три вышеуказанных направления исследований смогли объединиться только спустя почти век, преобразовавшись в современные молекулярную биологию и синтетическую теорию эволюции. На протяжении десятков лет ДНК считалась «бессмысленным веществом», даже после исследований группы Т.Х. Моргана, показавших, что местом локализации генов являются хромосомы, в 1920-1930 годы большинство биологов рассматривали ДНК, компонент хромосом, лишь в качестве «каркаса» для размещения белков, которым и приписывалась ключевая роль в хранении наследственной информации. Только проведенные в 1940-1950 годы опыты исследовательских групп О.Т. Эйвери по трансформации пневмококков и эксперимент А. Херши и М. Чейз с бактериофагами смогли однозначно установить роль ДНК в хранении наследственной информации. Расшифровка структуры ДНК Д. Уотсоном и Ф. Криком в 1953 г. помогла объяснить связь между строением данного полимера и его ролью в копировании и передаче наследственной информации.
|
|
|
Дальнейшее быстрое развитие молекулярной биологии смогло обеспечить не только получение информации о фундаментальных механизмах, лежащих в основе хранения и реализации генетической информации, но и снабдило исследователей надежными инструментами, которые впоследствии стали применяться для манипуляций с нуклеиновыми кислотами и позволили решить ряд важнейших практических задач. Так, в 1956 г. был открыт ключевой фермент, отвечающий за удвоение ДНК – ДНК-полимераза, в 1960 г. – РНК-полимераза, обеспечивающая процесс транскрипции, а в 1970 г. – обратная транскриптаза (фермент вирусов, осуществляющий синтез ДНК на матрице РНК), без которых было бы немыслимо дальнейшее развитие генной инженерии. Ключевым моментом для появления генной инженерии стало понимание того, что одним из свойств генетического кода, расшифрованного в 1966 г., является его универсальность (т.е. сходство в механизме кодирования наследственной информации у всех живых организмов). Это свойство позволяет осуществлять трансформацию – перенос генетической информации между организмами, находящимися даже в очень отдаленном родстве, и применять на практике технологии рекомбинантных ДНК (создание новых последовательностей ДНК за счет комбинирования ДНК из различных организмов). Таким образом, появилась возможность для создания организмов с направленными изменениями генотипа за счет использования технологий, значительно превосходящих по эффективности классические методы селекции с точки зрения сроков создания новых форм и точности при переносе отдельных генов.
|
|
|
В настоящее время молекулярная биология дает широкие возможности для фундаментальных исследований в области эволюции, физиологии, систематики различных групп организмов, а также осуществления прикладных разработок в сферах различных биотехнологий (медицинских, промышленных, природоохранных и т.д.).
Лабораторная работа № 1.
ОТРИЦАТЕЛЬНАЯ И ПОЛОЖИТЕЛЬНАЯ СУПЕРСПИРАЛИЗАЦИЯ. ФЕРМЕНТЫ ТОПОИЗОМЕРАЗЫ.
Задание 1. Зарисутейте схему формирования положительной и отрицательной спирализации ДНК. Используя рисунок 1.1, объясните, какое влияние положительная и отрицательная суперспирализация оказывают на процессы матричных синтезов, связанных с ДНК?
Рисунок 1.1. Образование положительных и отрицательных супервитков ДНК.
Задание 2. Рассмотрите структуру топоизомераз I и III типов, выделенные из E. Сoli (рис. 1.2.). Напишите, какие функции выполняют указанные домены.
Рисунок 1.2. Структура топоизомеразы I (слева) и топоизомеразы II (справа) из E. сoli.
Задание 3. Зарисуйте структуру ДНК-гиразы (рис 1.3.). Укажите, какие функции выполняют соответствующие домены. Заполните таблицу:
| Название субъединицы ДНК-гиразы | Количество субъединиц в ферменте | Функция субъединицы |
| GyrA | ||
| GyrB |
Рисунок 1.3. Структура (справа) и механизм действия (слева) ДНК-гиразы.
Задание 4. Зарисуйте схему, объясняющую механизм действия ДНК-гиразы (рис 1.3.).
Задание 5. Ответьте на вопросы:
1. Что понимают под процессивностью гиразы?
2. Поему модель, объясняющая механизм действия ДНК-гиразы при использовании кольцевой двухцепочечной молекулы ДНК в качестве субстрата за счет внесения отрицательных супервитков путем инверсии положительной суперспирали называется моделью «инверсии знака»?
|
|
|
3. В чем проявляется сходство в строении и функционировании ДНК-гиразы и топоизомеразы II низших эукариот?
Лабораторная работа № 2.
|
|
|
