Методическая революция в молекулярной биологии 1970-х годов

Современная молекулярная биология гена явилась результатом методической революции, которая за несколько лет полностью изменила лицо эксперимента. Хотя ключевыми здесь являются генная инженерия и секвенирование ДНК, другие методические подходы сыграли не меньшую роль. Чтобы сделать ясным дальнейшее изложение, кратко остановлюсь на этих основных методических подходах.

Гель-электрофорез нуклеиновых кислот. Если в 60-х годах разделение нуклеиновых кислот по молекулярным массам вели в основном путем ультрацентрифугирования в сахарозном градиенте, то в 70-х годах этот метод вытесняется методом электрофореза в геле. Впервые он был широко применен болгарским исследователем Р. Цаневым и сотр., и затем быстро завоевал общее признание. Оказалось, что в геле ДНК и РНК движутся тем быстрее, чем ниже их молекулярная масса. Пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму молекулярной массы. Особенно важно, что разрешающая способность метода благодаря низкой диффузии гораздо выше, чем у ультрацентрифугирования. Для низкомолекулярных нуклеиновых кислот электрофорез ведется в полиакриламидном геле, для высокомолекулярных - в агарозном. Чем ниже концентрация геля, тем более высокомолекулярные нуклеиновые кислоты могут в нем разделяться. Подбирая условия, можно разделить как короткие олигонуклеотиды, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид, так и молекулы ДНК размером до нескольких миллионов пар нуклеотидов.

Расщепление ДНК рестриктазами. В 1970 г. В. Арбер. (Швейцария) и Х. Смит (США) открыли рестриктазы - ферменты, с помощью которых бактерии расщепляют попавшую в них чужеродную ДНК. Эти эндонуклеазы узнают специфические последовательности ДНК и осуществляют по ним ее расщепление. Аналогичные последовательности в собственной ДНК не чувствительны к своей рестриктазе, так как они сразу после своего синтеза метилируются ферментом метилазой, узнающей те же самые последовательности. Рестриктазы II типа узнают обычно короткие палиндромы длиной 4-6 оснований. Например, популярная рестриктаза EcoRI узнает последовательность GAATTC/CTTAAG, расщепляя ее между G и А. У разных видов бактерий рестриктазы различны, они узнают разные последовательности, и поэтому почти всегда можно подобрать фермент, расщепляющий исследуемую ДНК-Ферменты, узнающие гексануклеотиды, расщепляют ДНК на более длинные фрагменты, чем ферменты, узнающие тетрануклеотиды. Комбинируя обработку разными рестриктазами с последующим гель-электрофорезом, можно прокартировать изучаемый фрагмент ДНК, т. е. расположить по его длине места узнавания различными рестриктазами.

Блот-гибридизация. ДНК, разделенную гель-электрофорезом, можно перенести с геля на нитроцеллюлозный фильтр. Для этого ее денатурируют в геле щелочью, нейтрализуют гель, и затем прикладывают к нему нитроцеллюлозный фильтр, обеспечивая медленный ток буфера через гель и фильтр. Денатурированная ДНК диффундирует и задерживается на фильтре, после нагревания которого в вакууме она "запекается" и иммобилизуется, т. е. обездвиживается на фильтре. Ее распределение на плоскости фильтра точно такое же, как и на плоскости геля. Однако в отличие от геля фильтр с ДНК можно использовать для последующей гибридизации с меченой пробой, т. е. с мечеными ДНК и РНК. Для этого инкубируют фильтр с раствором, содержащим меченую пробу, при повышенной температуре, затем тщательно отмывают его и, наконец, подвергают авторадиографии, т. е. выдерживают с рентгеновской фотопленкой. При проявлении последней на ней выявляются полосы, соответствующие полосам ДНК на фильтре, сгибридизо-вавшимся с радиоактивной пробой.

Процедура переноса ДНК с геля на фильтр обозначается английским термином blotting (промокание). Поэтому для таких фильтров с ДНК используется термин "блот" (blot). По имени автора Саузерна эти блоты называются "блотами Саузерна" (Southern blots).

Вместо ДНК можно перенести на фильтры с геля РНК. Такие фильтры называют Норзерн-фильтрами [игра слов: фамилия Саузерн означает "южный"; фильтры с ДНК по Саузерну - южные блоты; фильтры с РНК шутливо обозначили как северные блоты (Northern); фильтры с белками - как западные (Western)].

Получение высокомеченных проб. Чтобы проводить гибридизацию с Саузерн- и Норзерн-фильтрами, содержащими весьма малые количества индивидуальных ДНК и РНК, были нужны очень высокомеченные пробы. Их научились делать путем энзиматического введения метки в выделенные препараты нуклеиновых кислот. Наиболее распространенный метод - это так называемая ник-трансляция (nicktranslation). ДНК инкубируют с двумя ферментами, ДНК-полимеразой I и ДНКазой I (последняя берется в ничтожных количествах вместе с высокомеченными предшественниками ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфатами. ДНКаза вносит в двухцепочечную ДНК одноцепочечные разрывы. На эти места садится ДНК-полимераза и разрушает одну из цепей ДНК, одновременно заново ее застраивая, но используя при этом меченые предшественники. Таким образом, большая часть ДНК замещается радиоактивной, сохраняя при этом свою нуклеотидную последовательность. Есть и другие методы включения метки в ДНК и РНК.

Синтез ДНК по матрице РНК. В 1972 г. Г. Темин и Д. Балтимор (США) открыли обратную транскриптазу, или ревертазу, - фермент, осуществляющий синтез ДНК по матрице РНК. Его выделили из очищенных ретровирусов. Ревертаза нашла широкое применение в молекулярной биологии, особенно для синтеза ДНК на матрице мРНК. Большинство мРНК несут на своем 3'-конце поли(А)-последовательность (50-100 нуклеотидов длиной). Используя олигоT(dT) - затравку, осуществляют с помощью ревертазы синтез цепи ДНК, комплементарной мРНК (кДНК), а затем достраивают вторую цепь либо с помощью той же ревертазы, либо с помощью ДНК-полимеразы I (работающей на матрице ДНК) - Можно получить и меченую кДНК, если использовать меченые дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Полная ДНК-копия с мРНК содержит, очевидно, всю информацию для синтеза белка, т. е. соответствует структурной части того или иного гена.

Молекулярное клонирование. Ключевым методом явилось молекулярное клонирование фрагментов ДНК, или генная инженерия в узком смысле слова. Этот метод, впервые описанный П. Бергом в США, позволяет нарабатывать большие количества любого отрезка ДНК, встраивая его в ДНК бактериальной плазмиды или бактериофага и заражая такой рекомбинантной ДНК бактерию-хозяина. Чаще всего в плазмиду или фаг встраивают либо фрагменты эукариотической геномной ДНК, либо кДНК, полученную в результате обратной транскрипции мРНК. Когда работают с плазмидами, то обычно используют такие, которые несут ген устойчивости к какому-либо антибиотику. В результате на среде с антибиотиком растут и дают колонии лишь те бактерии, в которые проникли рекомбинантные плазмиды. Когда работают с фагом, то следят за возникновением бляшек, т. е. очагов размножения фага, ведущего в лизису (разрушению) бактерий. Каждая колония или бляшка, полученная из одной исходной клетки, содержит один тип плазмиды или фага, включающий один и тот же фрагмент чужеродной ДНК. Рассевая далее такие колонии, получают чистый клон.

Одна из главных задач - поиск нужного клона. Если есть меченая "проба", например кДНК, синтезированная на мРНК, то нужный клон находят с помощью гибридизации с колониями. Делают отпечаток с чашки, на которой растут колонии, на нитроцеллюлозном фильтре. Затем проводят гибридизацию фильтра с меченой ДНК и выявляют колонии, связывающие меченую пробу. Эти колонии далее пересевают и получают клон, содержащий нужный ген. Есть и много других методов вылавливания нужных клонов из их множества, получаемого на первом этапе эксперимента.

Скоростные методы определения нуклеотидной последовательности ДНК. Следующим важнейшим прорывом явилось создание методов, позволяющих быстро определить нуклеотидную последовательность в ДНК. Первый, химический, метод заключается в том, что у гомогенной ДНК (полученной с помощью рестриктаз) метится один конец, а затем в четырех разных порциях меченой ДНК проводят частичное расщепление цепи по тому или иному нуклеотиду (A+G, G, Т+С, С). Затем разделяют каждую смесь с помощью высокоразрешающего электрофореза на дорожках одного и того же геля. Гели высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой, на которой после проявления виден набор полос, соответствующих фрагментам ДНК, начинающимся с меченого нуклеотида и обрывающимся на том или ином нуклеотиде (в зависимости от химической модификации). Таким образом, "с листа", содержащего четыре дорожки, можно прямо читать нуклеотидные последовательности. Идея метода была выдвинута в СССР С. К. Василенко и Е. Д. Свердловым, методы химических модификаций разработаны в значительной мере А. Д. Мирзабековым, работа над созданием общего метода начата им же вместе с У. Гилбертом, а полное завершение метода дано А. Максамом и У. Гилбертом в США.

Другой, энзиматический, метод был разработан Ф. Сэнгером в Великобритании. Исследуемый фрагмент ДНК при клонировании встраивается рядом с определенной последовательностью, к которой имеется комплементарная затравка. Используя такую затравку, ведут синтез ДНК in vitro с помощью ДНК-полимеразы в присутствии меченых дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Иногда вместо меченых предшественников используют меченую затравку. В результате происходит считывание исследуемого фрагмента. В реакционную смесь, разделенную на четыре порции, добавляют по одному из четырех дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов в каждую. Последние способны включаться в растущую ДНК, вставая на правильное место, но затем останавливают дальнейший рост ДНК, терминируют ее синтез. Опять-таки проводят разделение смеси образовавшихся цепей ДНК электрофорезом и затем авторадиографию. По четырем дорожкам читают нуклеотидную последовательность ДНК.

Многочисленные усовершенствования методов позволяют сегодня в относительно короткие временные интервалы расшифровывать последовательности ДНК длиной в десятки тысяч нуклеотидов.

Естественно, было разработано и много других важных методических подходов. С описанием некоторых из них мы встретимся ниже. Однако перечисленные выше сыграли решающую роль по крайней мере на первом этапе исследований. Они фактически вызвали революцию в молекулярной биологии гена эукариот.

Лабораторная работа № 5.