 |
Методы центрифугирования для разделения клеток, субклеточных структур и биологических молекул
|
|
|
|
Основные компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: целые клетки и их фрагменты, ядра, хлоропласты, митохондрии, лизосомы, микросомы и рибосомы.
Препаративное центрифугирование заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований. С помощью преп. центр. выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется так же для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки из предварительно очищенных препаратов. Дифференциальное центрифугирование этот метод основан на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. Зонально-скоростное центрифугирование или s-зональное центрифугирование, заключается в наслаивание исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос. Благодаря созданию градиента плотности удается избежать смешивания зон, возникающего в результате конвекции. Метод зонально-скоростного центр. применяется для разделения гибридов РНК-ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.
Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых или практически чистых препаратов макромолекул или частиц. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярном весе и структуре материала. Определение молекулярного веса по скорости седиментации. Центрифугирование проводят при больших скоростях, так что частицы, вначале равномерно распределенные по всему объему, начинают упорядоченно перемещаться по радиусу от центра вращения. Между областью растворителя, уже свободной от частиц, и той его частью, которая их содержит, образуется четкая граница раздела. Эта граница при центрифугировании перемещается, что дает возможность определять скорость седиментации частиц, регистрируя это перемещение на фотопластинке. Коэффициент седиментации – это скорость, отнесенная к единице ускорения, его измеряют в единицах Сведберга(S). Метод седиментационного равновесия. Определение молекулярных весов проводится при небольших скоростях ротора, чтобы молекулы с большим молекулярным весом не опускались на дно. Недостаток этого метода является то, что для достижения седиментационного равновесия необходимо длительное время – от нескольких дней до нескольких недель непрерывной работе центрифуги. Метод приближения к седиментационному равновесию был разработан для того, чтобы избавиться от недостатков предыдущего метода, связанных с большими затратами времени, необходимого для установления равновесия. С помощью этого метода можно определять молекулярные веса, когда центрифугируемый раствор находится в состояние приближения равновесия. Вначале макромолекулы распределяются по всему объему аналитической ячейки равномерно; затем по мере центрифугирования молекулы оседают, и плотность раствора в области мениска постепенно уменьшается.
|
|
|
Билет 5
Мембранные технологии разделения биологического материала
|
|
|
Часто возникает необходимость сконцентрировать водные растворы макромолекул и удалить из них мелкие неорганические ионы. Самый распространенны способ концентрирования вещества – использование специфических мембран. Диффузия небольших молекул обеспечивается следующими факторами:
А) диализ – разность концентраций подлежащего удалению вещества в исследуемом растворе и чистом растворителе находящиеся по разным сторонам мембраны;
Б) ультрафильтрация – разность гидростатических давлений по обе стороны мембраны обеспечивающую диффузию молекул растворителя через мембрану;
В) электродиализ – при переносе ионов через мембрану – приложенным внешним электрическим полем;
Наиболее часто используют мембраны – это прозрачные целлюлозные пленки или трубочки, так же нецеллюлозные полиэлектролитные комплексы.
Диализ. Чтобы удалитьиз исследуемого раствора молекулы растворенного вещества, его помещают в целлюлозный мешочек и погружают в чистый растворитель (воду или буфер). Малые молекулы будут выходить из мешочка в растворитель до тех пор, пока их концентрации по обе стороны мембраны не выровняются. Для ускорения площадь диализного мешочка делают больше, помня о возможной потере макромолекул сорбции их на мембране.
Если осмотическое давление в исследуемом растворе и растворителе не одинаково, то по мере выхода из диализного мешочка растворенного вещества молекулы чистого растворителя будут проникать внутрь мембраны (явление осмоса), что приведет к разведению исследуемого раствора. Так же молекулы можно концентрировать путем диализа против растворов высокомолекулярных веществ и диализный мешочек можно подвешивать в струе воздуха.
Ультрафильтрация. Разность давления по обе стороны мембраны создается путем повышения давления со стороны фильтруемого раствора или понижения его в ультрафильтрате. Приборы для ультрофильтрации состоят из камеры особой конструкции, в которой создается положительное давление и снабжены магнитными мешалками.при ультрафильтрации небольших объемом разносто давлений может достигаться путем центрифугирования.
Электродиализ. Принципиально этот метод схож с электрофорезом, с разницей в том, что движение макромолекул ограничевает мембрана.
|
|
|
ЯМР-томография
ЯМР – томография (или МРТ) – это относительно новый вид получения изображения внутренних органов, который начал входить в медицинскую практику в 80-х годах прошлого столетия
ЯМР-томография принципиально отличается от рентгеновской компьютерной томографии, но тоже относится к лучевой диагностике. В чем же его отличие? Самое главное кроется в излучении, используемом для томографии. Это радиоволновой диапазон, обычно с длиной волны от 1 до 300 м. Почему же его сравнивают с КТ? Ответ прост. МРТ и КТ используют совершенно одинаковые принципы автоматического, управляемого компьютером сканирования, обработки и получения послойного изображения внутренней структуры органов. В чем же преимущества ЯМР-томографии?
· Первое преимущество – замена рентгеновских лучей радиоволнами. Это позволяет устранить ограничения на контингент обследуемых (детей, беременных), т.к. снимается понятие лучевой нагрузки на пациента и врача. Кроме того, отпадает необходимость в проведении специальных мероприятий по защите персонала и окружающей среды от рентгеновского излучения.
· Второе преимущество – чувствительность метода к отдельным жизненно важным изотопам и особенно к водороду, одному из самых распространенных элементов мягких тканей. При этом контрастность изображения на томограмме обеспечивается за счет разности в концентрациях водорода в различных участках органов и тканей. При этом исследованию не мешает фон от костных тканей, ведь концентрация водорода в них даже ниже, чем в окружающих тканях.
· Третье преимущество заключается в чувствительности к различным химическим связям у различным молекул, что повышает контрастность картинки.
· Четвертое преимущество кроется в изображении сосудистого русла без дополнительного контрастирования и даже с определением параметров кровотока.
· Пятое преимущество заключается в большей на сегодня разрешающей способности исследования – можно увидеть объекты размером в доли миллиметра.
|
|
|
· И, наконец, шестое – МРТ позволяет легко получать не только изображения поперечных срезов, но и продольных.
Конечно же, как и любая другая методика, ЯМР-томография имеет свои недостатки. К ним относят:
· Необходимость создания магнитного поля большой напряженности, что требует огромных энергозатрат при работе оборудования и/или использования дорогих технологий для обеспечения сверхпроводимости. Радует то, что в научной литературе нет данных об отрицательной влиянии на здоровье магнитов большой мощности.
· Низкая, особенно в сравнении с рентгенологическими, чувствительность метода ЯМР-томографии, что требует увеличения времени просвечивания. Это приводит к появлению искажений картинки от дыхательных движений (что особенно снижает эффективность исследования легких, исследовании сердца).
· Невозможность надежного выявления камней, кальцификатов, некоторых видов патологии костных структур.
· Невозможность обследования некоторых больных, например с клаустрофобией (боязнью закрытых пространств), искусственными водителями ритма, крупными металлическими имплантатами. Не следует забывать и о том, что относительное противопоказание для ЯМР-томографии - беременность. Ну а кардиостимуляторы – строгое противопоказание к исследованию.
В чем же техническая и физическая суть ЯМР-томографии? Ядерным магнитным резонансом называется избирательное поглощение электромагнитных волн (читайте, радиоволн) веществом (в данном случае телом человека), находящимся в магнитном поле, что возможно благодаря наличию ядер с ненулевым магнитным моментом. Во внешнем магнитном поле протоны и нейтроны этих ядер как маленькие магниты ориентируются строго определенным образом и меняют по этой причине свое энергетическое состояние. Расстояние между этими уровнями энергии столь мало, что переходы между ними способно вызвать даже радиоизлучение. Энергия радиоволн в миллиарды раз меньше, чем у рентгеновского излучения, поэтому они не могут вызвать какие-либо повреждения молекул. Итак, сначала происходит поглощение радиоволн. Затем происходит испускание радиоволн ядрами и переход их на более низкие энергетические уровни. И тот, и другой процесс можно зафиксировать, изучая спектры поглощения и излучения ядер. Эти спектры зависят от множества факторов и прежде всего – от величины магнитного поля. Для получения пространственного изображения в ЯМР-томографе, в отличие от КТ нет необходимости в механическом сканировании системой источник-детектор (антенна передатчик и приемник в случае ЯМР). Эта задача решается изменением напряженности магнитного поля в различных точках. Ведь при этом будет изменяться частота (длина волны), на которой происходит передача и прием сигнала. Если мы знаем величину напряженности поля в данной точке, то можем точно связать с ней передаваемый и принимаемый радиосигнал. Т.е. благодаря созданию неоднородного магнитного поля можно настраивать антенну на строго определенный участок органа или ткани без ее механического перемещения и снимать показания с этих точек, лишь меняя частоту приема волны.
|
|
|
Следующий этап – обработка информации от всех просканированных точек и формирование изображения. В результате компьютерной обработки информации получаются изображения органов и систем в «срезах», сосудистых структур в различных плоскостях, формируются трехмерные конструкции органов и тканей с высокой разрешающей способностью.
Последние революционизирующие изобретения в области ЯМР, включая удивительные методы получения ЯМР- изображений, убедительно свидетельствуют о том, что границы возможного в ЯМР почти безграничны. Замечательные преимущества ЯМР- интроскопии, которые будут высоко оценены человечеством и которые сейчас являются мощным стимулом стремительного развития ЯМР- интроскопии и широкого применения в медицине, заключаются в очень малой вредности для здоровья человека, свойственной этому новому методу.
Билет 6
|
|
|
