 |
А.Обнаружение полифенолоксидазы и пероксидазы
|
|
|
|
Оксидазами называют ферменты, активирующие молекулярный кислород (переносящие на него электроны от окисляемого вещества). Активированный таким образом кислород соединяется с отщепляемым от субстрата водородом, образуя воду или пероксид водорода по схеме:
2АН2 + О2 → 2А + 2Н2О
К этой группе ферментов относится полифенолоксидаза, окисляющая полифенолы кислородом воздуха с образованием соответствующих хинонов.
Пероксидаза - фермент, окисляющий полифенолы и ароматические амины кислородом пероксида водорода:
дифенол + Н2О2 → хинон + 2Н2О
Обнаружить полифенолоксилазу можно при помощи раствора гваяколовой смолы, который в присутствии этого фермента изменяет окраску из желтой в синюю. Объясняется это тем, что содержащиеся в гваяколовой смоле полифенолы, не способные самопроизвольно реагировать с молекулярным кислородом, окисляются активированным кислородом.
Для обнаружения пероксидазы можно использовать ту же реакцию окисления полифенолов гваяколовой смолы. Но так как пероксидаза с молекулярным кислородом не реагирует, к раствору гваяколовой смолы необходимо добавить пероксид водорода.
Работу удобно проводить на двух срезах исследуемой части растения, нанося на первый срез раствор гваяколовой смолы, на второй – растворы гваяколовой смолы и пероксида водорода: изменение окраски первого среза свидетельствует о присутствии в клетках полифенолокисдазы, тогда как посинение второго среза есть результат совместного действия двух ферментов – полифенолокисдазы и пероксидазы или, в случае отсутствия в данном объекте первого фермента, – одной пероксидазы (показатель присутствия обоих ферментов – более быстрое посинение второго среза).
|
|
|
Ход работы
Поместить на стекло два среза клубня картофеля и нанести на них одновременно раствор гваяколовой смолы, причем второй срез дополнительно обработать каплей раствора пероксида водорода. Для контроля обработать таким же образом материал, предварительно подвергнутый кипячению (вареный картофель).
Исследовать несколько объектов, не допуская при этом попадения сока из одного объекта на срез другого (скальпель, используемый для разрезания исследуемых объектов, необходимо каждый раз мыть и вытирать).
Зарисовать результаты опыта, отмечая скорость появления синей окраски. В выводах указать наличие или отсутствие в исследуемых объектах полифенолоксидазы и пероксидазы и ориентировочно оценить активность этих ферментов (полифенолоксидазы - по посинению 1-го среза, пероксидазы – по разности скоростей посинения 2-го и 1-го срезов).
Б. Обнаружение каталазы.
Каталаза выполняет в клетках функцию обезвреживания очень активного и потому опасного для живых клеток окислителя – пероксида водорода, катализируя реакцию:
2Н2О2 → 2 Н2О + О2
Этот фермент особенно активен в молодых растущих тканях, а также в зеленых листьях, где участвует в процессе фотодыхания.
Ход работы
Готовят срезы листьев толщиной 0,5-1 мм, с побегов элодеи можно отрывать целые листья. Часть срезов и листьев убивают, опуская их в кипящую воду.
Живые и убитые срезы помещают на предметное стекло в капле воды и добавляют несколько капель раствора перекиси водорода. В микроскоп на малом увеличении рассматривают срезы и отмечают появление пузырьков кислорода.
Результаты зарисовывают, объясняя появление пузырьков кислорода или их отсутствие.
В. Определение активности каталазы газометрическим методом.
Об активности каталазы можно судить по объему кислорода, выделившегося в результате разложения перекиси водорода. Работу проводят на газометрической установке в специальных пробирках-каталазниках.
|
|
|
Ход работы
Навеску растительного материала (0,5 г) растирают в ступке в 5 мл дистиллированной воды, добавляя немного мела для создания щелочной реакции. Экстракт, используя стеклянную палочку,осторожно переносят в одно колено каталазника. В другое колено помещают 5 мл 3% перекиси водорода. Затем, не допуская перемешивания содержимого каталазника, его соединяют каучуковой трубкой с газоизмерительной установкой (рис.5), показания которой выставлены на «0», а зажим закрыт.
Открывают зажим, быстрым изменением положения каталазника смешивают содержимое в обоих коленах и замечают начало экспозиции.
Аккуратно покачивая каталазник, определяют объем выделившегося кислорода по понижению уровня жидкости в бюретке. Рекомендуемая экспозиция: 1-3 мин.
Во время опыта нельзя держать каталазник плотно всей ладонью, так как при нагревании воздух в нем расширится, что может повлиять на точность результатов. По окончании опыта зажим открывают и отсоединяют каталазник.
Активность каталазы пересчитывают в млО2/г сырого веса. Делают вывод об активности фермента в разных органах растения, растениях разного возраста и систематического положения.
Материалы и оборудование:
1. Клубни картофеля – свежий и вареный
2. Побеги различных растений, листья элодеи
3. 1%-ный спиртовой раствор гваяколовой смолы (1г гваяколовой смолы растворить при нагревании в водяной бане в 70 мл этилового спирта, профильтровать и добавить 30 мл дистиллированной воды. Хранить в плотно закрытой посуде в холодильнике)
4. 3%-ный раствор Н2О2
5. Скальпели;
6. Ножницы
7. Микроскопы
8. Стекло
9. Стаканы с водой
10. Фильтровальная бумага.
11. Технические весы с разновесами
12. Ступки с пестиками
13. Мел в порошке
14. Каталазники
15. Пипетки на 5 мл
16.Газометрическая установка для определения активности каталазы, заполненная подкрашенной жидкостью
17.Секундомер или часы
Работа 10. Определение интенсивности дыхания растений по поглощению кислорода манометрическим методом Варбурга
Манометрические методы широко применяются при исследовании любых процессов, протекающих с выделением или поглощением газов. Преимуществом этих методов является большая чувствительность, незначительный расход опытного материала; возможность, не прерывая опыта (путём ряда отсчётов), изучать динамику процесса.
|
|
|
Манометрический метод, разработанный О. Г. Варбургом для оценки интенсивности дыхания, основан на определении количества выделенного СО2 или поглощённого объектом О2 по изменению давления в замкнутой системе при постоянном объёме и температуре. Давление измеряется с помощью чувствительного манометра. Манометр состоит из U-образной капиллярной трубки, заполненной специальной, не смачивающей стенки манометра жидкостью (рис.5).
Замкнутым пространством служат опытные сосудики, присоединённые посредством шлифа к правой ветви манометра. Объём замкнутого пространства, таким образом, складывается из объёма сосудика и прилегающей части манометра (объёма капилляра до уровня в нём манометрической жидкости). Постоянство объёма системы достигается тем, что пред началом измерений и каждым последующим отсчётом мениск манометрической жидкости в соединённой с сосудиком правой ветви манометра подводят к условно выбранному одному и тому же значению (150 мм). Об изменении давления газа в системе судят по уровню манометрической жидкости в левой (открытой) ветви манометра.
Основным условием использования этого метода для изучения газообмена при дыхании, где участвуют два газа, является регистрация изменений в давлении одного газа. Так, если дыхание оценивается по интенсивности поглощения О2, изменение парциального давления другого газа (СО2) искусственно должно быть приведено к нулю. Последнее достигается введением в замкнутую систему (в боковой отросток или центральный цилиндр сосудика) раствора КОН. Раствор КОН поглощает выделяющуюся углекислоту.
|
|
|
