А. Условия надежности результата РИА

А. Условия надежности результата РИА

1. При разведении пробы измеренная концентрация вещества должна уменьшаться пропорционально степени разведения.

2. Кривая зависимости уровня связывания антител с меченным антигеном от концентрации антигена в пробе должна совпадать с калибровочной кривой.

Если эти условия не выполняются, можно предположить, что на иммунохимическую реакцию влияют факторы, перечисленные ниже. Надо отметить, что правильно интерпретированный результат РИА может иметь диагностическое значение, даже если он не удовлетворяет формальным критериям надежности (например, из-за иммунохимических различий между стандартом и пробой).

Б. Факторы, неспецифически влияющие на иммунохимическую реакцию

1. pH. Скорость реакции антиген—антитело и стабильность иммунных комплексов обычно не зависят от pH в интервале 7, 0—8, 5. Как правило, в очень кислой или очень щелочной среде иммунные комплексы диссоциируют, хотя некоторые белки с основными свойствами лучше всего взаимодействуют с антителами при pH 4, 0—6, 0. Поэтому для каждой системы РИА подбирают оптимальный pH.

2. Состав реакционной смеси также влияет на реакцию антиген—антитело. Энергия взаимодействия антигена с антителом уменьшается при высокой концентрации солей в пробе или в реакционной смеси. Некоторые лекарственные средства (гепарин) и бактерицидные препараты (тиомерсал) подавляют иммунохимическую реакцию. Поэтому для разведения стандартов и проб используют один и тот же буферный раствор и учитывают возможные эффекты компонентов реакционной смеси.

В. Перекрестная иммунореактивность веществ со сходным строением

1. Гетерогенность молекулярных форм пептидных гормонов

а. Пептидные гормоны синтезируются в виде белков-предшественников, которые перед выбросом в кровь подвергаются процессингу. При этом образуется одна или несколько форм гормона, обладающих или не обладающих биологической активностью. Например, при процессинге секретина и ВИП образуется только по одной биологически активной форме каждого гормона. Напротив, гастрин, синтезируемый клетками антрального отдела привратника, поступает в кровь как в виде зрелого гормона, состоящего из 17 аминокислот, так и в виде биологически активного предшественника, содержащего 34 аминокислоты. Оба пептида определяются в одной и той же системе РИА.

б. На результаты РИА влияют биологически неактивные молекулярные фрагменты гормонов, такие, как C-концевой фрагмент ПТГ. Концентрация этого фрагмента в сыворотке в норме превышает концентрацию зрелого ПТГ (ПТГ_1—84), а при болезнях почек существенно увеличивается (даже у больных без вторичного гиперпаратиреоза). Поскольку для определения ПТГ обычно используют антитела к C-концевому фрагменту, правильная интерпретация результата требует оценки функции почек. Концентрацию ПТГ_1—84 в плазме можно определить с помощью высокочувствительного иммунорадиометрического метода, основанного на использовании двух разных антител: к C- и N-концевому фрагментам ПТГ. Антитела к C-концевому фрагменту иммобилизируют на полимерном носителе. Затем добавляют пробы или стандарты (растворы ПТГ_1—84 в сыворотке, предварительно очищенной от ПТГ и его фрагментов) и меченные ¹²⁵I антитела к N-концевому фрагменту ПТГ. Антитела, иммобилизированные на носителе, связывают как C-концевой фрагмент, так и ПТГ_1—84, но антитела к N-концевому фрагменту связываются только с ПТГ_1—84. Такой подход используют и в других случаях, когда в пробе присутствуют молекулярные фрагменты гормона.

в. У животных разных видов первичные структуры одного и того же пептидного гормона могут быть идентичными, но чаще различаются по одной или нескольким аминокислотам. Аминокислотные замены возникают в результате мутаций и, как правило, локализуются в участках молекулы гормона, не играющих первостепенной роли в его биологической активности. Различия в первичной структуре определяют иммунореактивность гормона.

2. Гетерогенность других соединений

а. Лекарственные средства и наркотики. Вещества, структурно сходные с препаратом, и его метаболиты могут связываться или не связываться с антителами. Если измеряют содержание токсичного препарата, то необходимо знать, выявляет ли данная методика только активную форму препарата. Напротив, если требуется доказать употребление наркотика, то различия в иммунореактивности между самим наркотиком и его метаболитами можно не учитывать. Таким образом, требования к специфичности РИА зависят от цели анализа.

б. Ферменты. РИА позволяет измерять содержание фермента, но не его активность. Ингибиторы и активаторы фермента и присутствие субстрата не влияют на результат. В одной и той же системе можно определять как сам фермент, так и профермент и другие неактивные формы фермента. В зависимости от задач исследования эти особенности метода могут играть положительную или отрицательную роль, поскольку многие ферменты обладают видовой специфичностью, а биологическая активность фермента необязательно коррелирует с его иммунохимической реактивностью. Поэтому РИА следует рассматривать как дополнение к методам анализа ферментов, основанным на определении их активности, а не как замену этих методов.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: