Операционно-ламинарные боксы. Термостатируемая комната. Компоненты сред.. Приготовление сред.

Операционно-ламинарные боксы.

Если нет шкафа, то стерильный стол.

Ламинарный бокс для стерильных манипуляций.

В нерабочее время помещение кварцуют, в т. ч. внутри ламинарного бокса.

Рабочую поверхность бокса и стола протирают спиртом или формалином. Стерильный стол используют при отсутствии ламинарного бокса, и при его использовании на каждый край ставят горелку Бунзена или спиртовку.

Термостатируемая комната.

Где есть устройство кондиционирования, t=25 2⁰C. Режим освещения в зависимости от требований к растущим культурам. Напр. для некоторых культур нужен свет. Для этого используют стеллажи с трубчатыми лампами, под каждым стеллажом на потолке. Могут быть шкафы для культур с теневым выращиванием, в этом случае применяемые обычные закрытые шкафы или все комнаты могут сделать темной.

Суспензионные культуры не должны слипаться, поэтому их должны выращиваться при постоянном перемешивании в качалках, которое делают (оборот в секунду и отклоняют ось вращения на несколько см по вертикали). В качалках или в самой комнате может быть установлен режим смены дня и ночи.

Компоненты сред.

Каждая среда независимо от назначения имеет 6 компонентов:

1. микроэлементы

2. макроэлементы

3. источник железа

4. источник углерода

5. витамины

6. стимуляторы роста, которые подбираются к каждому виду.

Ауксины:

ИУК(индолилуксусная кислота)

ИМК(индолилмасляная кислота)

НУК(нафтилуксусная кислота)

НОУК(хлорфинилоксиуксусная кислота)

Цитокинины:

6-БАП-(6-бензиламинопурин)

2-ИП(изопентиламинопурин)

Кинетин (фурфуриламинопурин)

Зеатин.

Гиббереллины:

ГК (гибберелловая кислота)

ИУК окисляется продуктами метаболизма тканей, его нельзя использовать как единственный ауксин.

Зеатин и ГК- термолобильны и их нельзя автоклавировать.

Одним из компонентов среды, дающие ей желирующие свойства являются, напр. (из водорослей) его кладу 6 гр на 1 л среды.

 

Подбор регуляторов роста:

0               1          2           3        4        5 А 0

                          А-3-4

                          Ц-3-4

 

 

 

                                                                                            Ц

МС-(мурасиге-скуга)

 

Приготовление сред.

Среды: высокосолевые (Мурасиге-Скуга, Шенка-Хиледебрандта); низкосолевые - (Уайта)

Среды либо готовят сами (в лаборатории), либо используют готовые порошки, в которых входят все компоненты, кроме сахарозы, агара и регуляторов роста. Но такие среды, несмотря на удобство, не могут быть изменены и дорого стоят. В лаборатории же имея стандартный набор посуды и необходимые реактивы можно приготовить любую среду.

Методика приготовления:

Берут пропись и готовят растворы исходных солей. Растворять их можно в химическом стакане на магнитной мешалке. В последствии растворы объединяют, и объем доводится до риски дважды дистиллированной средой. Все компоненты растворяются стерильной дважды дистиллированной водой. Все соли используют марки ХЧ - химически - чистые, ЧДА - чистые для анализа. Приготовленную среду разливают в конические колбы Эрленмейера по 250 мл, затыкают ватными пробками и оборачивают горлышко фольгой.

Автоклавируют при 115⁰С (до 150⁰С) и при давлении 1, 1 атм (до 24) 20 мин(чем больше V, тем больше t).

Готовую среду остужают напр., в ламинарном боксе, где можно подлить термолабильные компоненты, а так же их там разливают по чашкам петри.

Готовую среду лучше не хранить во избежание заражения. Если же все-таки храним, то это делают 1 месяц с обязательным последовательным посевом, а лучше с пробой самих колб на стерильность. Для этого среду помещают в термостат при t-25⁰С на 4 дня. Если через 4 дня не проявляются признаки заражения грибами или микроорганизмами среду можно использовать. Среды, хранятся при t +4⁰С. Растворы основных солей +4⁰С, а витамины при -20⁰С хранятся 1 месяц (по 2 мл в колбочке).

Метод посева применяетсядля определения факта заражения сред, физиологических жидкостей, водных смывов с любых поверхностей(они со стен в операционных, автоклавной, и т. д. )). Для смыва со стен берут стерильную кисточку.

Эксплант- часть растения, которая должна быть по возможности наиболее молодой, чтобы не возникло трудностей, либо конкретная ткань, которую нужно размножить. Желательно чтобы эксплант был теристемой- вечно молодой тканью(кончик побега, корня, кисток). Размер экспланта зависит от размера его клеток, чем больше размер клеток, тем больше размер экспланта, т. к. существует критическое количество жизнеспособных клеток для каллусных культур. Перед тем как эксплант помещают на среду, его нужно отобрать и простерилизировать.

Стерилизация экспланта:

Эксплант должен быть стерилен, чтобы не заражать среду и одновременно жив, чтобы расти. Поэтому используют хлорсодержащие жидкости 1% активного хлора.

ПР: Раствор гипохлоританатрия. Для лучшего прилипания гидрохлорита натрия и водоотталкивающим гидрофобным поверхностям используют смачиватели - детергенты (типол). При стерилизации некоторых тканей их даже оставляют набухать, напр., кожура семян, чтобы открылись микротрещинки.

Как правило, стерилизованный экплант идет в несколько этапов, т. е. замачивают в гидрохлорите натрия и промывают дважды дистиллированной водой, затем это может повторяться.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: