Выращивание эксплантов

В готовую среду, разлитую по чашечкам петри вдавливают эксплант. Если лист кладут горизонтально, стебель вертикально. Если среда подобрана правильно, то через месяц можно будет разделить растущий каллус (растущая ткань в результате деления клеток, т. е. пролифирации). Каллус можно разделить на несколько частей с соблюдением правильного размера экспланта. Если можно разделить на 10 частей, то через 6 месяцев 1000000 каллусов.

В условиях клонирования настоящей коэффициент разложен ниже из за неизбежной мутации и деградации клонов, которые составляют некоторый %.

Этапы микроклонального размножения:

1. Выбор растения – донора, изоляция эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда получают максимальное количество жизнеспособных эксплантов.

3. Укоренение размножающихся побегов с последующей адаптацией к почве, а при необходимости - депонирование растений-регенерантов при t +2+10⁰С.

4. Выращивание растений в полевых условиях (in vivo).

На первом этапе используют антибиотики (тетрациклин, особенно у древесных, а так же преимущественно мурасиге-скуга, а так же ауксины и цитокинины). Преимущественно антиоксиданты применяются для подавления терпенов и полифенолов, которые выделяют хвоиные, либо вплоть до суток промывают экспланты, либо добавляют антиоксиданты в среду.

Второй этап собственно микроразмножения, когда добиваются получения максимального количества микроклонов с учетом неизбежного появления растений с ненормальным морфологией и генетикой используют так же среду мурасиге -скуга и регулятор роста. При данном культивировании с повышенным содержанием цитокининов они могут накапливаться и отравлять каллусы (кусочки растений) может быть подавлена пролифирация, а так же наблюдается обводнение побегов и ослабление укоренения. Проблема решается минимизацией цитокинина в растворе, либо чередование цикл с высоким и низким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы – укоренение и адаптация к почвенным условиям, а также высадка имеют основной состав среды, уменьшение концентрацию солей и применяя среду Уайта, уменьшая концентрацию сахара и исключают цитокинин. Для стимуляции корнеобразования вводят НУК и ИМК. Укоренения побегов проводят 2 способами:

1. Выдерживают микропобеги до суток в стерильном концентрате культивируемого на агаре без гормонов или даже сразу в почвенном субстрате(импульсная обработка).

2. непосредственная культивация микропобегов до месяца на среде, содержащей ауксин или даже в гидропонике, что может значительно повысить степень укоренения и упростить его, а так же адаптировать растения к среде. Целесообразно затенять нижнюю часть культивируемых сосудов черной материей или добавляется в среду активированный уголь. Выращивание растений и каллуссов в чашках Петри, пробирках называется in vitro. Пересадка регенерантов в субстраты очень ответственное мероприятие которое приходится на весну, начало лета растения с 2-3 листьями и хорошо укоренившись осторожно извлекают из пробирок пинцетом, корни отмывают от агара, и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85-90⁰С в течении 2 часов. Состав субстрата: торф и песок 3: 1., а так же торф – дерновая почва и перлит поровну, а также торф, песок, теозолит поровну. Растения - регенеранты выращенные в пикеровочных горшочках, температурный режим в теплице 20-22⁰С, освещен, не более 5 тыс. люкс, влажность 65-90%. В домашних или лабораторных условиях горшочки накрывают стеклянными банками, которые постепенно открывают до полной адаптации через 20-30 дней после посадки хорошо укоренившихся растения подкармливают солями мурасиге-скуга. По мере роста растения рассаживают в большие емкости, а дальше используют как обычный посадочный материал. Наиболее сложным процессом является адаптация пробирочных растений в почве, поскольку нарушена деятельность устьиц, а у некоторых растений в условиях in vitro отсутствуют корневые волоски, что приводит к обезвоживанию, поглощения минеральных солей. Поэтому крайне целесообразно искусственно микоризация. Индусы предложили простой метод предотвращения обезвоживания во время пересадки в полевые условия или в грунт: листья опрыскивали-50% водяным раствором- глицерина или смесью парафина или искуга с диэтиловым эфиром 1: 1. Метод помогает избежать длительных дополиваний и обеспечить 100% приживаемость.

  Методы (разновидности) МКР.

Основной метод -активация существующих меристем при снятии апикального доминирования (доминирующие верхушки).

2 пути: 1) Удаление верхушечных меристем стебля, чтобы убрать источники гармонов с последующим микрочередованием побега in vitro

2) Добавление в питательную среду цитокининов (6-БАП).

Полученные побеги отделяют от экспланта и вновь культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулируют пролиферацию (деление клеток) пазушных меристем, возникают побеги более высоких порядков. Используют метод для размножения плодовых культур, ряда древесных и множества травянистых. Из 1 меристемы 105 растений в год.

2метод индукция возникающих адвентивных почек из ткани экспланта - основан на способности к регенерации любых организмов и тканей в единое целое растение. Питательная среда содержит 100% цитокинина, иногда 10% ауксина- самый распространенный метод для размножения цветов, овощей и др. Морфогенетическая активность экспланта продолжается до 4 лет, из 1 растения в год до миллиона в год.

3 метод дифференциация соматических клеток в зародышеподобные структуры, напоминающие обычные зиготические зародыши, которые получаются из экспланта. Основное отличие образовавшегося зародыша in vitro от in vivo в том, что соматический зародыш развивается из ткани экспланта асексуально вне зародышевого мешка и напоминает биполярную структуру с одновременным развитием стебля и корня.

Они проходят 3 стадии развития:

- глобулярная стадия;

- сердцевидная стадия;

-торпедовидная стадия, развивается в проросток.

Таким путем можно размножать часть древесных пород (дуб, ель…). Формирование эмбрионов происходит в 2 этапа. 1) дифферинциация клеток экспланта за счет добавления в среду ауксинов. 2) На следующей стадии сформировавшиеся клетки развиваются в эмбриоиды при отсутствии ауксинов в среде.

Соматический эмбриогенез происходит в тканях первичного экспланта и в каллусной культуре, как правило, эмбриогенез проводят в суспензионной культуре, однако при этом полностью исключается такой опасный этап как адаптация растений к среде, поскольку соматический зародыш копирует свойство настоящего. При использовании соответственной техники капсуляции эмбриоидов можно получить искусственные семена.

4 метод Дифференциация адвентивных почек в первичные пересадочные каллусные ткани. Метод используется очень редко, т. к., чреват накоплением мутаций, вплоть до полиплоидии, а также возможной низкорослостью и неправильным расположением листьев. Однако есть и положительные моменты, т. к., этот метод экономически эффективен, поскольку из каждой клетки может образоваться новое растение. Только так можно размножать растения в культуре тканей и в трех методах очень важен для селекции по хозяйственно-ценным признакам. Этот метод показан для растений со стабильной генетикой каллуса и слабой изменчивостью растений-регенерантов.