 |
Глава 2.3. Механизмы регуляции мышечного сокращения
|
|
|
|
Мышца не могла бы выполнять свою функцию, если бы она постоянно находилась в сокращенном состоянии. Для ее эффективной работы необходимо, чтобы в мышце были специальные «выключатели», которые позволяли бы головке миозина «шагать» по нити актина только в строго определенных условиях (например, при химической или электрической стимуляции мышцы). Сигналом для начала мышечного сокращения является кратковременное увеличение концентрации ионов Са2 + внутри мышцы с 10-7 до 10-5 М.
Таким образом, для регуляции сокращения необходимы специальные регуляторные системы, которые могли бы отслеживать изменения концентрации Са2+ внутри клетки. Регуляторные белки располагаются на тонком и толстом филаментах или находятся в цитоплазме. В зависимости от того, где располагаются Са-связывающие белки, принято различать так называемый миозиновый и актиновый типы регуляции сократительной активности.
2.3.1. Актиновый механизм регуляции. Актиновый механизм регуляции характерен для поперечнополосатых мышц - скелетных и сердечной - и осуществляется с помощью белков тропомиозина и тропонина. Тропонин, соединяясь с тропомиозином, образует комплекс, названный нативным тропомиозином. Этот комплекс прикрепляется к актиновым филаментам (см. рис. 2.7 и 2.14) и придает актомиозину скелетных мышц позвоночных чувствительность к ионам Са2+. Каждый тропониновый комплекс связывает четыре иона кальция. Тропониновые комплексы расположены вдоль актинового филамента через каждые 40 нм, прикрепляясь одновременно к актиновому филаменту и молекуле тропомиозина.
Нативный тропомиозин, как уже упоминалось, препятствует присоединению миозиновых головок к актину. Тропомиозин мышц состоит из двух субъединиц по 33 кД (284 аминокислоты). Димер представляет собой палочковидную структуру длиной около 40 нм. Тропомиозин взаимодействует с латеральной частью актинового филамента, с одной стороны, и с тропониновым комплексом, - с другой. Имеется множество изоформ тропомиозина, экспрессирующихся тканеспецифическим образом и различающихся по молекулярному весу и изоэлектрической точке. Связывание тропомиозина с актиновыми филаментами стабилизирует их, предотвращает их спонтанную фрагментацию.
|
|
|
Рис. 2.14. Схематическое изображение взаимодействия с актином комплекса тропомиозина (светло-голубой) и тропонина (субъединицы тропонина: TnT - розовая, TnC - желтая, TnI - голубая) (согласно [16])
В состав тропонина входят три субъединицы - С, I и Т (Тn-I, Тn-С, Тn-Т), каждая из которых выполняет специфические функции. Тропонин С обеспечивает связывание иона Са2+, тропонин I ингибирует АТР-азную активность актомиозина, тропонин Т обеспечивает прикрепление тропонина к тропомиозину. По данным электронной микроскопии, молекула тропонина Т в составе тонкого филамента имеет форму запятой или палочки, лежащей в канавке спирали актина и вытянутой вдоль филамента, длиной 185-205 Ао. С-концевой глобулярный домен тропонина Т обеспечивает контакт компонентов тропонина как с актином, так и тропомиозином (вблизи Cys190). Вытянутая N-концевая часть тропонина Т формирует хвостик запятой. Эта часть молекулы имеет вариабельную первичную структуру из-за альтернативного сплайсинга коротких экзонов и взаимодействует с С-концом одного димера тропомиозина и N-концом другого (соседнего) димера. Вследствие этого тропонин Т может влиять на взаимодействие двух соседних димеров тропомиозина и процессы полимеризации тропомиозина, а также на взаимодействие тропомиозина с актином. В структуре тропонина Т три тропомиозинсвязывающих центра: N-концевой участок (остатки 1-159), второй участок, ограниченный остатками 156-227, образующий тройную суперспираль с тропомиозином и контактирующий с тропонином С, третий участок (остатки 227-259), так же как и второй центр, контактирует с тропомиозином вблизи Cys190. Взаимодействие второго и третьего центров тропонина Т с тропомиозином зависит от концентрации Са2+ (рис. 2.15).
|
|
|
Рис. 2.15. Схематическое изображение взаимодействия нативного тропомиозина с актином. Тропонин Т1 и С-концевая часть тропонина Т отмечены желтым цветом, ингибирующая область и С-конец тропонина I - фиолетовым, тропонин С - красным, тропомиозин - коричневым, актин - зеленым. Овалы изображают сайты связывания компонентов тропонинового комплекса с тропомиозином-актином в отсутствие ионов Са2+ (согласно [20])
Субъединица тропонинового комплекса, связывающая ион Са2+ и инициирующая мыщечное сокращение - тропонин С, - имеет пространственную структуру, аналогичную структуре другого Са2+-связывающего белка - кальмодулина. Тропонин С состоит из двух глобулярных N- и С-концевых доменов, содержащих по две металлсвязывающих последовательности типа «EF-hand», и соединяющего эти два домена центрального спирализованного полипептида (рис. 2.16). Тропонин С может связать четыре иона Са2+, при этом сайты I и II в N-концевой части молекулы тропонина С характеризуются низким сродством к ионам Са2+, а сайты III и IV в С-концевой части молекулы связывают как ионы Са2+, так и ионы Mg2+, при чем сайты высокого сродства к ионам Са2+ насыщены этими ионами даже при низкой концетрации Са2+ в саркоплазме.
Рис. 2.16. Структура тропонина С. Сайты низкого сродства к ионам Са2+ I и II - в N-концевой части молекулы тропонина С, сайты высокого сродства III и IV - в C-концевой части молекулы тропонина С. Каждый участок связывания иона Са2+ представляет собой последовательность спираль-петля- спираль, называемую мотив «EF-hand». Сайт I - спираль А, петля, спираль В; сайт II - спираль С, петля, спираль D, далее центральная линкерная цепь, сайт III - спираль Е, петля, спираль F; сайт IV - спираль G, петля, спираль H. Ионы Са2+ изображены черным цветом. Структура тропонина С представлена в закрытой (слева) и открытой (справа) конформациях (спирали В и С располагаются перпендикулярно к центральной линкерной спирали в открытой конформации и параллельно ей в закрытой конформации) (согласно [10])
|
|
|
Рис. 2.17. Аминокислотный состав Са-связывающих участков III и IV С-концевого домена тропонина С (согласно [18])
Участки связывания Са2+ образованы так называемой «EF-hand» последовательностью cостава DxDxDG. На рис. 2.17 приведены аминокислотные остатки «EF-hand» последовательности для сайтов III и IV тропонина С, среди которых присутствует три остатка Asp. В насыщенном ионами Са2+ С-концевом домене спирали, ограничивающие Са-связывающие участки (спирали F, G, Н), располагаются почти под прямым углом к центральной спирали, а в N-концевом домене, свободном от ионов Са2+, спирали В и С почти параллельны центральной спирали. В отсутствие ионов Са2+ Са-связывающие центры находятся в так называемой закрытой форме. В этом состоянии гидрофобные остатки спиралей Са-связывающих петель контактируют друг с другом, скрыты от растворителя. Связывание Са2+ регуляторными центрами (сайтами I и II) приводит к удалению спиралей В и С от центральной спирали, при этом спирали В и С ориентируются почти под прямым углом по отношению к центральной спирали. Взаимное перемещение спиралей приводит к экспонированию части гидрофобных остатков, располагающихся в области контакта центральной спирали со спиралями В и С. Са-связывающие центры переходят в так называемое открытое состояние. Экспонирование этих остатков играет ключевую роль в образовании прочных контактов между тропонином С и тропонином I, главной функцией которого является ингибирование АТР-азной активности актомиозина.
Тропонин I и тропонин С образуют прочный комплекс. По данным рентгеноструктурного анализа, полипептидные цепи тропони- на I и тропонина С ориентированы антипараллельно, а центральная или С-концевая области тропонина I могут взаимодействовать с N-концевым глобулярным доменом согнутого в середине центральной спирали тропонина С. По данным ЯМР, ингибиторные остатки 96-116 тропонина I взаимодействуют с остатками 1-7 и 19-44 актина, т. е. располагаются вблизи участков, обеспечивающих взаимодействие актина с миозином. В структуре тропонина I есть как минимум два ингибиторных участка, при этом основной ингибиторный пептид (остатки 96-116) имеет форму шпильки, образованной двумя жестко ориентированными относительно друг друга a-спиралями. В отсутствие Са2+ ингибиторные участки тропонина I взаимодействуют с актином, а в присутствии Са2+ эти ингибиторные участки диссоциируют от актина и взаимодействуют с гидрофобными сайтами в центральной спирали и N-концевом домене тропонина С. По данным малоуглового рентгеновского рассеяния, бинарный комп- лекс тропонин I - тропонин С имеет вытянутую форму и тропонин I как бы «оплетает» распрямленную молекулу тропонина С (рис. 2.18).
|
|
|
Рис. 2.18. Модельная структура комплекса тропонин I - тропонин С. N-концевой домен тропонина С изображен вверху. Тропонин С (белого цвета) представлен ввиде Ван-дер-Ваальсовых сфер. Изображены пять участков тропонина I: остатки 3-33 - голубые, остатки 34-53 - зеленые, остатки 54-94 - желтые, ингибиторный пептид (95-114) - красный, остатки 115-134 - розовые. Ингибиторный пептид красного цвета может связываться то с актином, то с тропонином С (согласно [21])
С помощью метода химических сшивок было установлено, что в полном тропониновом комплексе тропонин I находится также вблизи от тропонина Т и прочность их взаимодействия зависит от концентрации ионов Са2+. Участок взаимодействия с тропонином Т располагается в области остатков 40-96 тропонина I, т. е. оказывается зажатым между участками, ограниченными остатками 1-40 и 96-148 тропонина I и участвующими в его взаимодействии с тропонином С. Такое расположение участков взаимодействия делает возможной передачу конформационного сигнала, индуцированного связыванием ионов Са2+ с тропонином С, через тропонин I на тропонин Т и тропомиозин.
В отсутствие ионов Са2+ тропонин увеличивает вероятность того, что тропомиозин выкатывается из канавки актина и занимает такое положение на нити актина, при котором часть центров связывания на актине способна слабо связывать головки миозина, но не способна переходить от слабого типа связывания к сильному. В присутствии ионов Са2+ прочность связи тропонина I с актином ослабевает. Тропонин I и связанные с ним компоненты тропонина удаляются от актина на большее расстояние и перестают стерически блокировать взаимодействие головок миозина с актином (рис. 2.19).
Рис. 2.19. Схематическое изображение регуляции сокращения поперечнополосатых мышц с помощью тропонинового комплекса: А - ингибирование, В - активация мышечного сокращения (согласно [14])
|
|
|
Рис. 2.20. Изменение положения тропомиозина при сокращении мышц под действием ионов Са2+ (согласно [8])
Кроме того, после насыщения ионами Са2+ тропонин сдвигает равновесие между двумя состояниями тропомиозина на актиновом филаменте в сторону так называемого включенного состояния, когда тропомиозин не мешает ни слабому, ни сильному связыванию головок миозина с актином. Димер тропомиозина имеет достаточно жесткую структуру. Поэтому вызванное тропонином перемещение тропомиозина передается на всю регуляторную единицу, т. е. на все семь мономеров актина. Перемещение тропомиозина из выключенного во включенное положение достигается не только под действием тропонина. Присоединение даже одной головки миозина на семь мономеров актина приводит к выталкиванию тропомиозина из блокирующего положения. Перемещение тропомиозина, вызванное связыванием головки миозина, обусловлено не только механическим выталкиванием тропомиозина, но и изменением структуры актина, что и приводит к перемещению тропомиозина из одного положения в другое, при этом перемещение тропомиозина происходит не только в данной, но и в соседних регуляторных единицах, расположенных справа и слева от данной регуляторной единицы (рис. 2.20).
2.3.2. Миозиновая регуляция сокращения мышц. В немышечных и гладкомышечных клетках регуляция актомиозинового взаимодействия происходит в основном посредством фосфорилирования миозина и изменения концентрации ионов Са2+. Молекула миозина имеет несколько сайтов фосфорилирования. Однако регуляторное значение четко показано в настоящее время лишь для сайта, расположенного на одной из легких цепей миозина - регуляторной (РЛЦМ). В дефосфорилированном виде РЛЦМ предотвращает связывание миозиновых головок с актином. Фосфорилирование РЛЦМ по Ser19 приводит к активации миозиновой АТР-азы для взаимодействия с актином и осуществляется специальным ферментом - киназой легкой цепи миозина (КЛЦМ). КЛЦМ сама по себе также является регулируемым ферментом. Она cтановится активной только в присутствии насыщенного ионами Са2+ кальмодулина. Фосфорилирование РЛЦМ приводит к следующим последствиям. Во-первых, происходит конформационное изменение миозина. Если у нефосфорилированного миозина хвост обычно имеет форму петли (свернутая конфигурация) и такой миозин не способен образовывать филаменты (рис. 2.21), а значит и участвовать во взаимодействии с актином, то у фосфорилированного миозина хвост выпрямлен.
Рис. 2.21. Структура нефосфорилированного миозина в гладких мышцах (согласно [12])
Во-вторых, фосфорилирование КЛЦМ активирует миозин, нарушает внутримолекулярные связи, приводит к распрямлению молекул миозина и стимулирует полимеризацию гладкомышечного и немышечного миозинов в активные филаменты, готовые к генерации силы. В-третьих, происходит значительное повышение активности активируемой актином Mg2+-зависимой АТР-азы миозина.
Киназа легких цепей миозина относится к группе протеинкиназ - ферментов, способных переносить концевой остаток фосфата АТР на оксигруппы остатков серина или треонина белка. В состоянии покоя при низкой концентрации Са2+ в цитоплазме киназа легких цепей миозина неактивна. Это связано с тем, что в структуре фермента в С-концевой части есть специальный ингибиторный участок. Этот участок (в нем особенно важна последовательность Arg797-Lys799) содержит много остатков основных аминокислот Lys и Arg, способных реагировать с кислыми аминокислотными остатками (Glu777 и Glu821) внутри активного центра КЦЛМ. По своему аминокислотному составу этот участок аналогичен участку узнавания и фосфорилирования субстрата КЦЛМ - регуляторной легкой цепи миозина, включающему первые семнадцать остатков на N-конце РЛЦМ. Для узнавания субстрата строго необходим Arg16, а удаление последовательности Lys11-Lys12-Arg13 полностью подавляет реакцию фосфорилирования. На основании сказанного выше ингибиторный участок КЛЦМ может выступать в качестве псевдосубстрата.
Рис. 2.22. Структура кальмодулина. Ионы Са2+ изображены черными шариками. Латинскими буквами от А до Н представлены спиральные участки в сайтах связывания ионов Са2+ (согласно [17])
Ингибиторный участок (псевдосубстрат) попадает в активный центр фермента и, не давая возможности взаимодействовать с истинным субстратом, полностью блокирует его активность, а именно аминокислотные остатки, ответственные за связывание с кальмодулином и реакцию фосфорилирования: Trp800, Gly804, Ile810, Glu811, Arg812, Leu813 (при этом существенный остаток Trp обнаружен в активных центрах всех кальмодулинзависимых белков, его замена на другие остатки приводит к полной потере активности даже при насыщающих концентрациях иона Са2+). Фермент как бы усыпляет сам себя. В цитоплазме гладких мышц присутствует кальмодулин (его структура приведена на рис. 2.22), который в отсутствие ионов Са2+ и при взаимодействии с ними ведет себя аналогично тропонину С. Связывание Са2+ вызывает изменения в его структуре. Повышение уровня Са2+ сопровождается насыщением N-концевых Са2+-связывающих участков кальмодулина и экспонированием гидрофобных остатков в его N-концевом домене. Складываясь, молекула кальмодулина обвивает регуляторный сегмент КЛЦМ по направлению к его С-концу, наиболее приближенному к активному центру КЛЦМ, и тем самым блокирует взаимодействие автоингибиторной последовательности КЛЦМ с активным центром, отводя ее в сторону (рис. 2.23). КЛЦМ словно просыпается. Фермент начинает узнавать свой субстрат и переносит остаток фосфата от АТР на остаток Ser19, расположенный около N-конца РЛЦМ. Фосфорилирование регуляторной легкой цепи миозина приводит к значительным изменениям структуры как самой легкой цепи, так, по-видимому, и тяжелой цепи миозина в области ее контакта с легкой цепью. Только после фосфорилирования легкой цепи миозин оказывается способным взаимодействовать с актином и начинается мышечное сокращение.
Рис. 2.23. Пространственная модель комплекса (Са2+)4-кальмодулина и КЛЦМ. КЛЦМ изображена в виде свернутого жгута в центре, ионы Са2+ в виде зеленых шариков (согласно [22])
Понижение концентрации кальция в клетке вызывает диссоциацию ионов Са2+ из катионсвязывающих центров кальмодулина. Кальмодулин диссоциирует от КЛЦМ, которая тут же теряет свою активность, взаимодействуя со своим ингибиторным пептидом и опять впадая в спячку. Но пока легкие цепи миозина находятся в фосфорилированном состоянии, миозин продолжает осуществлять циклическое протягивание нитей актина. Для того, чтобы остановить циклические движения головок, надо удалить остаток фосфата с регуляторной легкой цепи миозина. Этот процесс осуществляется под действием фосфатазы легких цепей миозина (ФЛЦМ), активность которой не зависит от концентрации Са2+. Фосфатаза катализирует быстрое удаление остатков фосфата с регуляторной легкой цепи миозина. Дефосфорилированный миозин не способен осуществлять циклические движения своей головкой и подтягивать нити актина. Наступает расслабление.
При гиперактивации КЛЦМ развивается спазм и ишемическое поражение тканей, например, инфаркт миокарда в случае коронарных артерий или инсульт при спазме сосудов головного мозга. Снижение активности КЛЦМ, напротив, приводит к расслаблению сократительной системы гладких мышц сосудов, снижению артериального давления и восстановлению кровоснабжения сердца. На этом основано действие некоторых кардиологических препаратов (антагонистов кальция, нитратов, папаверина и b-блокаторов).
Одна из легких цепей миозина в скелетных мышцах тоже может подвергаться фосфорилированию, но это не влияет на активируемую актином миозиновую АТР-азу. Фосфорилирование легкой цепи миозина в скелетной мышце может лишь увеличить скорость образования поперечных мостиков между миозиновыми головками и актином.
|
|
|
