 |
Белки-репортеры в гибридных белках
|
|
|
|
В рассмотренных выше библиотеках пептидов последние ковалентно связаны с белком-носителем. В таком виде они являются одними из представителей гибридных белков, получаемых методами генной инженерии.
В другом случае гибридные белки применяют для получения высокого уровня экспрессии коротких пептидов в бактериальных клетках благодаря стабилизации этих пептидов в составе гибридных белков. Часто гибридные белки используют для идентификации и очистки трудноопределяемых рекомбинантных белков. Например, присоединив к С-концу исследуемого белка в качестве белка-репортера b-галактозидазу, можно производить очистку рекомбинантного белка по активности b-галактозидазы, определяя ее антигенные детерминанты иммунохимическими методами. Соединяя фрагменты ДНК, содержащие открытые рамки считывания (ОРС), с генами белков-репортеров, можно очистить такие гибридные белки по активности белка-репортера и использовать их для иммунизации лабораторных животных. Полученные антитела далее применяют для очистки нативного белка, в состав которого входит рекомбинантный полипептид, кодируемый ОРС, и тем самым идентифицируют клонированный фрагмент гена.
С помощью гибридных белков решают и обратную задачу клонирования неизвестного гена, к белковому продукту которого имеются антитела. В таком случае конструируют клонотеку последовательностей нуклеотидов, представляющих ОРС неизвестных генов, в векторах, которые позволяют соединять клонируемую ОРС в одной рамке считывания с геном-репортером. Образующиеся в результате экспрессии этих рекомбинантных генов гибридные белки идентифицируются с помощью антител иммуноферментными методами. Гибридные гены, объединяющие секретируемые белки и белки-репортеры, дают возможность по-новому исследовать механизмы секреции, а также локализацию и перемещение в тканях секретируемых белков.
|
|
|
Гибридные токсины
Серия работ И. Пастана с сотрудниками по конструированию гибридных токсинов направленного действия прекрасно иллюстрирует возможности белковой инженерии в части комбинирования различных функциональных доменов белков для достижения конкретных биологических эффектов.
Рис. II.22. Лекарственные препараты направленного действия на основе гибридных токсинов
а – обобщенная схема структуры лекарственного препарата направленного действия; б – строение псевдомонадного токсина (цифрами обозначено положение аминокислотных остатков); в – строение гибридного токсина; г – гибридный токсин на основе моноклональных антител
Идеальное лекарственное средство строго специфического избирательного действия должно обладать, по крайней мере, следующими структурно-функциональными особенностями (рис. II.22, а). Такой лекарственный препарат должен заключать в себе действующее начало для достижения физиологического эффекта и лиганд, распознающий рецептор на поверхности клеток-мишеней. Кроме того, в нем должны быть структурные элементы, распознаваемые системой транспорта организма, для доставки лекарства к клеткам-мишеням, а также спейсерный участок, необходимый для отделения действующего начала от остальных функциональных частей препарата после его доставки по адресу. Именно такая идеальная схема реализуется в природном экзотоксине Pseudomonas aeruginosa. Экзотоксин А P. aeruginosaпредставляет собой белок, состоящий из одной полипептидной цепи длиной в 613 аминокислот, которая организована в три функциональных домена (см. рис. II.22, б). N-Концевой домен Ia (аминокислотные остатки 1–252) необходим для взаимодействия с поверхностью клеток-мишеней (прототип лиганда идеального лекарства направленного действия). Функции домена Ib (аминокислотные остатки 365–404) в настоящее время неизвестны. Домен II (аминокислотные остатки 253–364) обеспечивает эффективный перенос токсина в цитозоль клеток (система транспорта лекарства), а домен III (аминокислотные остатки 405–613) осуществляет ADP-рибозилирование фактора элонгации трансляции EF2, что приводит к подавлению трансляции и гибели клеток-мишеней. Таким образом, для оказания цитотоксического действия экзотоксину A необходимо с помощью домена Iа распознать рецепторы на поверхности клеток, проникнуть в клетку с помощью эндоцитоза, опосредованного рецепторами, и быть транслоцированным через внутреннюю мембрану в цитозоль, где локализуется фактор EF2. Основная идея в создании токсинов направленного действия заключалась в том, чтобы заменить домен Iа на какой-либо иной пептидный лиганд, взаимодействующий с другой группой рецепторов на поверхности клеток, и тем самым изменить специфичность действия токсина в отношении самих клеток (см. рис. II.22, в).
|
|
|
Было установлено, что удаление домена Iа генно-инженерными методами резко (в сотни и тысячи раз) снижает токсичность такого укороченного белка как в отношении клеток различных линий, так и in vivo. Присоединение к С-концевой части укороченного полипептида молекулы интерлейкина 2 человека осуществляли путем объединения структурных частей соответствующих генов в экспрессирующем векторе. Очищенный гибридный токсин оказался чрезвычайно токсичным в отношении клеток, несущих на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2, и не действовал на клетки, у которых эти рецепторы отсутствовали и которые погибали под действием природного токсина. Интернализация (транслокация внутрь клеток) гибридного токсина была опосредована субъединицами р55 и р70 рецептора интерлейкина 2. Таким образом, в результате действия гибридного токсина на популяцию клеток, часть из которых экспрессирует на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2, происходит избирательная гибель именно этих клеток.
В организме большинство покоящихся T-клеток и T-клеток памяти не экспрессируют на своей поверхности высокоаффинных рецепторов интерлейкина 2, тогда как T-клетки, стимулированные аллоантигенами, содержат такие рецепторы. Поэтому внутрибрюшинное введение гибридного токсина крысам с экспериментальным артритом – заболеванием, обусловленным патологической активацией T-клеток, снижало симптомы заболевания. Гибридный токсин существенно уменьшал у мышей и реакции отторжения трансплантата.
|
|
|
Вслед за этими пионерскими работами последовала целая серия исследований, направленных на создание аналогичных систем адресной доставки различных цитотоксических полипептидов. В процессе дальнейшего усовершенствования системы адресной доставки псевдомонадного токсина с использованием интерлейкина 2 в качестве лиганда отказались от полного удаления адресного домена токсина и ограничились его инактивацией путем введения в ген токсина четырех сайт-специфических мутаций. Молекулы такого гибридного токсина оказались в 10–100 раз более эффективными цитотоксическими агентами против клеток человека и обезьян, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы для интерлейкина 2, а также обладали значительно большим временем полужизни в крови мышей in vivo по сравнению с ранее полученной конструкцией.
На основе псевдомонадного токсина были созданы гибридные токсины, содержащие в качестве лигандов полипептидные цепи интерлейкина 4, интерлейкина 6, трансформирующего фактора роста типа a и инсулиноподобного фактора роста I. Для всех этих гибридных белков была показана высокоспецифическая цитотоксичность в отношении опухолевых клеток (включая клетки миеломы человека), обладающих соответствующими рецепторами. Использование в гибридном токсине в качестве лиганда части полипептидной цепи CD4 – гликопротеина поверхности T-клеток, который является рецептором вируса ВИЧ и взаимодействует с его гликопротеином gp120, позволило избирательно поражать T-клетки, зараженные вирусом ВИЧ и экспрессирующие на своей поверхности вирусный белок gp120.
Тот же принцип подавления инфекции, вызванной вирусами ВИЧ, растворимыми рецепторами CD4 был использован при конструировании гибридных белков, объединяющих части полипептидных цепей CD4 с константными частями тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов человека. При этом в процессе объединения генов были удалены последовательности нуклеотидов, кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены CD4, а также вариабельную часть полипептидных цепей иммуноглобулинов. Образующиеся гибридные молекулы, названные иммуноадгезинами, за счет константной части молекулы иммуноглобулина приобретали повышенную стабильность в организме и, кроме того, сохраняли специфические свойства, опосредуемые константными частями иммуноглобулинов: связывание Fс-рецептора и белка A, способность к фиксации комплемента и перенос через плацентарный барьер. Совокупность всех этих свойств давала возможность иммуноадгезинам эффективно прерывать инфекцию T-клеток вирусом ВИЧ-I, блокируя как сам вирус, так и зараженные им клетки, экспрессирующие на своей поверхности вирусный антиген gp120.
|
|
|
Дальнейшее усовершенствование генно-инженерных конструкций на основе псевдомонадного экзотоксина А произошло после того, как в качестве адресной части гибридного токсина стали использовать вариабельные домены моноклональных антител к компоненту p55 рецептора интерлейкина 2 человека. В этом рекомбинантном белке с помощью 15-звенного пептидного линкера аминокислот соединяли вариабельный домен тяжелой цепи этого иммуноглобулина с вариабельным доменом его легкой цепи, а С-конец легкой цепи – с N-концом укороченного псевдомонадного токсина (см. рис. II.22, г). Такие молекулы гибридного токсина также оказались высокоспецифичными цитотоксическими агентами по отношению к лейкозным клеткам человека, экспрессирующим на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2.
Разработанный подход продемонстрировал возможность использования специфических антител в качестве адресных частей гибридных токсинов. Это дает в руки исследователей универсальный способ адресной доставки токсинов, который в будущем позволит оказывать цитотоксическое действие на любые группы клеток, экспрессирующих на своей поверхности специфические антигены, т.е. значительно расширить количество мишеней для химиотерапевтических воздействий с использованием рекомбинантных белков.
Помимо псевдомонадного экзотоксина A в качестве действующего начала в гибридных токсинах успешно применяли дифтерийный токсин, фактор некроза опухолей и A-цепь рицина. Поскольку A-белок избирательно взаимодействует с константными (Fс) частями иммуноглобулинов класса G многих млекопитающих, такой гибридный токсин в паре с иммуноглобулином, полученным против какого-либо антигена на поверхности клеток, избирательно связывается с этими клетками и убивает их. Такие иммунотоксины являются еще одним потенциальным противоопухолевым агентом и могут быть использованы против клеток, экспрессирующих на своей поверхности специфические антигены.
|
|
|
Рис. II.23. Использование гибридного белка для регуляции экспрессии гена
Методы генной инженерии открывают безграничные возможности конструирования новых белков путем объединения в разных комбинациях различных функциональных доменов полипептидных цепей. Получение гибридных токсинов направленного действия иллюстрирует возможности такого подхода в белковой инженерии. В качестве последней иллюстрации возможностей этой группы методов рассмотрим гибридный белок как новый регулятор активности генов. При конструировании такого белка методами генной инженерии был заменен ДНК-связывающий домен в рецепторе глюкокортикоидных гормонов на соответствующий домен LexA-репрессора E. coli (рис. II.23).
Введение операторной последовательности гена lexA в область промотора глобинового гена (или других генов) приводило к активации промотора под действием гибридного белка в присутствии дексаметазона – синтетического гормона, взаимодействующего с рецептором глюкокортикоидов. Таким образом, в новом генетическом окружении последовательность нуклеотидов оператора гена lexA E. coli функционировала в качестве энхансера транскрипции в присутствии гибридного белка-активатора, узнающего эту последовательность. Результаты работы демонстрируют возможность создания новых белков – регуляторов активности генов путем комбинирования известных функциональных доменов.
Развитие белковой инженерии во многом сдерживается недостатком знания о структурно-функциональных взаимоотношениях в белках, что обусловлено сложностью объекта исследования. Многочисленные работы, направленные на изучение таких связей, как правило, носят эмпирический характер и завершаются локализацией аминокислот, существенных для функционирования активных центров ферментов. Поэтому основная задача белковой инженерии – по известной последовательности аминокислотных остатков получить белок с заданными свойствами – в настоящее время еще далека от своего разрешения. Тем не менее, уже сейчас иногда удается целенаправленно изменять некоторые свойства существующих ферментов путем замен небольшого числа аминокислотных остатков их полипептидных цепей с помощью направленного мутагенеза.
|
|
|
