 |
7. Микроскопическое изучение микроорганизмов в световом, люминесцентном, темнополь- ном, фазовоконтрастном и электронном микроскопах. Простые и сложные (по Граму, Циль-Нильсену, Романовскому-Гимза) методы окраски микробов.
|
|
|
|
7. Микроскопическое изучение микроорганизмов в световом, люминесцентном, темнополь- ном, фазовоконтрастном и электронном микроскопах. Простые и сложные (по Граму, Циль-Нильсену, Романовскому-Гимза) методы окраски микробов.
Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0, 2 мкм (бактерии, простейшие и т. п. ), электронные для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.
«сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90—100 х.
Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии — кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива.
Правила работы с иммерсионной системой:
1. установить микроскоп на малое увеличение;
2. навести максимальную освещенность (зеркало, конденсор, диафрагма);
3. установить препарат на столик;
4. нанести каплю масла на препарат;
5. установить иммерсионный объектив;
6. опустить объектив в каплю масла при помощи макровинта;
|
|
|
7. наблюдая в окуляр вращать макровинт до появления изображения;
8. микровинтом установить более четкое изображение;
9. провести микроскопию мазка с описанием морфологических свойств;
10. поднять тубус вверх, снять препарат и очистить объектив от масла;
11. установить микроскоп в нейтральное положение (малое увеличение, тубус вниз).
Существует несколько модификаций светового микроскопа, а, следовательно, и несколько видов световой микроскопии. Большинство бактериальных объектов прозрачны в видимом свете. Окрашенные препараты не позволяют определить некоторые морфологические свойства таких объектов. Для исследования живых нефиксированных и неокрашенных объектов применяют устройства:
Фазово-контрастное устройство обеспечивает четкое изображение объектов. В основе метода лежит изменение фазы световых лучей при прохождении их через прозрачные объекты. Человеческий глаз выявляет только различия в длине (цвет) и амплитуде (интенсивность) световой волны, но не позволяет выявить различия в фазе. С помощью устройства различия в фазе превращаются в изменение амплитуды. Устройство представляет собой прозрачный диск, на поверхности которого напылено кольцо из металла (фазовое кольцо), расположенный в задней плоскости объектива; и кольцевую диафрагму (светонепроницаемая пластина с прозрачным кольцевидным участком), помещенная под конденсором.
Темнопольный конденсор отличается от обычного тем, что пропускает только косые краевые лучи источника света, которые ввиду сильного наклона не попадают в объектив, в результате поле зрения микроскопа остается темным. На объект попадают только боковые лучи, отраженные от внутренних зеркальных поверхностей конденсора. Эти лучи отражаются в линзу объектива и позволяют видеть светлое изображение на темном фоне.
|
|
|
Методы окраски препаратов
1. по Граму
На мазок накладывают полоска фильтровальной бумаги и наливают на нее рабочий раствор генцианвиолета. Если есть готовые бумажки, пропитанные этой краской, то их кладут на мазки матовой стороной вверх и наливают несколько капель воды. Через две мин. Бумажки снимают, краску сливают (не промывают), а на препарат наносят раствор Люголя на 1 мин. (до почернения мазка), после чего раствор сливают, а мазок обесцвечивают этиловым спиртом до прекращения отхождения краски (около 30 сек. ). Затем мазок промывают водой, и стряхнув воду, докрашивают мазок фуксином Пфейфера 30-60 сек. Или сафранином 2 мин.! Надо строго соблюдать определенные сроки препарата, особенно спиртом: при его передержке можно обесцветить грамположительные микробы
по Циль-Нильсену – окрашивание кислотоустойчивых микроорганизмов
(микобактерии ярко-красные, все прочие бактерии синие).
Мазок фиксируют над пламенем, накрывают полосой фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый фуксин Циля и нагревают с появлением паров 3-5 мин, периодически проводя стекло над пламенем, но не доводя до кипения; при этом надо доливать краску на мазок. Препарату дают остыть, удаляют бумажку, промывают водой; обесцвечивают 5 %-ным раствором серной
|
|
|
