 |
В. Диагностические методы. 1. Идентификация возбудителя. 1. 2. 1. Чувствительность и надежность метода
|
|
|
|
В. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
1. Идентификация возбудителя
Вирус лейкоза КРС – экзогенный ретровирус, который принадлежит роду Deltaretrovirus подсемейства Orthoretrovirinae семейства Retroviridae. Структурно и функционально он связан с Т-лимфотропными вирусами приматов 1, 2 и 3 (STLV-1, -2, -3) и с Т-лимфотропными вирусами человека 1 и 2 (HTLV-1 и -2). Основными целевыми клетками вируса лейкоза КРС являются В лимфоциты (Beyer et al., 2002; Gillet et al., 2007). Вирусная частица состоит из одноцепочечной РНК, нуклеопротеина p12, капсидного (сердцевинного) белка р24, трансмембранного гликопротеина gp30, оболочечного гликопротеина gp51 и нескольких ферментов, включая обратную транскриптазу. Провирусная ДНК, которая образуется после обратной транскрипции вирусного генома, произвольно интегрируется в ДНК клетки хозяина, где персистирует, не производя при этом вирусного потомства. При культивировании инфицированных клеток in-vitro (как правило, путем совместного культивирования МКПК с индикаторными клетками) инфекционный вирус легче всего произвести путем стимуляции митогенами.
1. 1. Выделение вируса
От 1, 5 мл периферической крови в этилен-диамин-тетрауксусной кислоте (ЭДТК) отделяютмононуклеарные клетки переферической крови (МКПК), используя фиколл/ натрий метризоат градиент плотности, культивируют с 2× 106 клетками легких плода КРС (FBL) и затем выращивают в течение 3-4 дней в 40 мл минимальной питательной среды (МЕМ), содержащей 20% телячью сыворотку. Вирус вызывает образование синтиция в клеточном монослое FBL клеток. При отсутствии клеток легких плода КРС можно приготовить суточнуые культуры путем культивирования МКПК в 24-луночных планшетах в течение 3 дней (Miller et al., 1985). После этого с помощью радиоиммуноанализа (РИА), твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблоттинга или иммунодиффузии в агаровом геле (AGID) в супернатанте культур можно обнаружить антигены p 24 и gp51. Наличие частиц или провируса вируса лейкоза КРС можно продемонстрировать путем проведения электронной микроскопии и ПЦР, соответственно.
|
|
|
1. 2. Обнаружение нуклеиновой кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения провируса вируса лейкоза КРС описано во многих работах (Beier et al., 1998; Blankenstein et al., 1998; Belak & Ballagi-Pordany, 1993; Rola & Kuzmak, 2002; Teifke & Vahlenkamp, 2008; Venables et al., 1997). Использование праймеров, созданных для соответствующих gag, pol и env участков генома, имело переменный успех. В настоящее время гнездовая ПЦР с последующим гель-электрофорезом является наиболее быстрым и чувствительным методом. Описанные методы основаны на последовательностях праймеров из гена env, кодирующих антиген gp51. Данный ген хорошо сохраняется, а ген и антиген в целом присутствуют у всех инфицированных животных в ходе всего периода инфекции. Данный метод может быть использован только в тех лабораториях, которые располагают помещениями для молекулярной вирусологии. Для обеспечения достоверности результатов необходимо соблюдать обычные меры предосторожности и процедуры контроля (смотрите Главу 1. 1. 6 Принципы и методы валидации диагностических исследований инфекционных болезней).
ПЦР в основном проводят в дополнение к серологическим методам для подтверждения. Обнаружение инфекции вирусом лейкоза КРС у отдельных животных с помощью ПЦР может быть целесообразным в следующих случаях:
• • Молодые телята с колостральными антителами;
• • Случаи опухолей, для дифференциации спорадической и инфекционной лимфомы;
• • Опухолевые ткани из подозрительных случаев, отобранные на бойне;
|
|
|
• • Новые инфекции до развития антител к вирусу лейкоза КРС;
• • Случаи слабоположительных или сомнительных результатов ИФА;
• • Систематический скрининг КРС на станциях по исследованию потомства (перед ввозом в центры по искусственному осеменению);
• • КРС, используемый для производства вакцин, для гарантии их свободы от вируса лейкоза КРС.
1. 2. 1. Чувствительность и надежность метода
i) Аналитическая чувствительность
Несмотря на то, что гнездовая ПЦР теоретически обладает чувствительностью в одну целевую молекулу, на практике аналитическая чувствительность составляет примерно 5-10 целевых молекул провирусной ДНК.
ii) Ложно-положительные результаты
Высокая чувствительность гнездовой ПЦР может вызвать проблемы, связанные с ложно-положительными результатами по причине контаминации между образцами (Belak & Ballagi-
Pordany, 1993). Чтобы свести к минимуму данный риск, в протокол были включены некоторые специальные процедуры, такие как использование вытяжных шкафов с ламинарным потоком воздуха, отдельных помещений для различных этапов производства, использование в ходе каждого исследования новых перчаток или специальных открывалок для пробирок, а также отрицательных контролей (например, воды в качестве контрольного раствора).
iii) Ложно-отрицательные результаты
Необходимо отметить, что инфицировать можно лишь небольшую часть МКПК, что ограничивает чувствительность испытания. Наличие в некоторых образцах ингибиторов может привести к возникновению ложно-отрицательных результатов. Чтобы этого избежать в ходе каждого испытания используют хотя бы один положительный контроль. Кроме того, во время тестирования необходимо использовать внутренние контроли (имитаторы), которые добавляют к каждому образцу. Имитатор – это модифицированная целевая молекула с теми же праймерами, что и реальная цель, однако он генерирует продукт ПЦР другого размера, который можно визуализировать с помощью гель-электрофореза. Имитатор добавляют в низкой концентрации, что облегчает амплификацию реальной цели (Ballagi-Pordany & Belak, 1996). Тем не менее, существует возможность, что имитатор будет конкурировать с реальной целью. Таким образом, может понадобиться анализ каждого образца с имитатором и без него.
|
|
|
