 |
2.2.2. Антиген. 2.2.3. Известная положительна контрольная сыворотка. 2.2.4. Известная отрицательная контрольная сыворотка
|
|
|
|
2. 2. 2. Антиген
Антиген должен содержать специфический гликопротеин gp51 вируса лейкоза КРС. Антиген готовят в подходящей системе культуры клеток, такой как перманентно инфицированные монослои клеток почек эбриона овцы. Клетки, используемые для производства антигена вируса лейкоза КРС, должны быть свободными от нецитопатического вируса вирусной диареи КРС и ретровирусов КРС, вируса подобного иммунодефициту КРС (лентивируса) и синцитиального вируса КРС (спумавируса). После 3-4 дней культивирования при температуре 37º С ростовую среду заменяют поддерживающей средой. Клетки собирают через 7 дней, используя стандартный раствор трипсин/версен. Суспензию клеток центрифугируют при 500 ɡ в течение 10 минут. Клетки ресуспендируют в ростовой среде; 30% клеток возвращают в сосуд для культивирования, а оставшиеся сливают. Собирают супернатанты со всех культур. С помощью доступных методов супернатанты концентрируют в 50-100 раз. Это можно осуществить путем концентрации в мешках Вискинга, погруженных в полиэтиленгликоль, или путем осаждения сульфатом аммония и последующей ультрафильтрации, или путем осаждения в полиэтиленгликоле с последующим обессоливанием и сепарацией по
размерам в колонке с полиакриламидными шариками. Антиген содержит преимущественно gp51, но может также содержать р24.
Антиген можно стандартизировать для гликопротеина gp51 путем титрации против референтной сыворотки МЭБ Е05 следующим образом: готовят двукратное разведение антигена. Наивысшее разведение, которое при исследовании против неразбавленной референтной сыворотки МЭБ Е05 дает линию преципитации, равноотстоящую от антигена и сыворотки, будет содержать одну единицу. В исследовании используется две единицы антигена.
|
|
|
2. 2. 3. Известная положительна контрольная сыворотка
Положительную контрольную сыворотку получают от естественно или экспериментально инфицированных животных (КРС или овец). Образовавшаяся линия преципитации должна представлять собой четкую линию между лунками с антигеном и лунками с контрольной сывороткой. В исследование в качестве индикатора чувствительности необходимо включить разведение контрольной положительной сыворотки, которое дает слабоположительный результат.
2. 2. 4. Известная отрицательная контрольная сыворотка
Используют сыворотку от неинфицированных животных (КРС, овец).
2. 2. 5. Тестовые сыворотки
Подходят сыворотки от любых видов животных.
2. 2. 6. Процедура тестирования
i) Агар растапливают путем нагревания на водяной бане и разливают по чашкам Петри (15 мл на чашку диаметром 8, 5 см). Заполненные планшеты оставляют для остывания при температуре 4º С примерно на1 час, прежде чем вырезать в агаре отверстия. Для того, чтобы вырезать шестигранник, состоящий из шести лунок вокруг центральной лунки, используют пробойник. Могут быть использованы различные размеры лунок; одна удовлетворительная модель, например, включала лунки диаметром 6, 5 мм, а расстояние между лунками составляло 3 мм. Для получения наиболее достоверных результатов планшеты с агаром используют в тот же день, когда агар был розлит и вырезан.
ii) Антиген помещают в центральные лунки шестигранника. Тестовые сыворотки помещают поочередно с положительной контрольной сывороткой во внешние лунки. В каждом планшете должен быть один контрольный паттерн с положительной контрольной сывороткой, слабоположительной контрольной
сывороткой и отрицательной контрольной сывороткой на месте тестовых сывороток.
iii) Планшеты выдерживают при комнатной температуре (20-27º С) в закрытой влажной камере, а результаты считывают через 24, 48 и 72 часа.
|
|
|
iv) Интерпретация результатов: тестовая сыворотка является положительной, если она формирует специфическую линию преципитации с антигеном и линию идентичности с контрольной сывороткой. Тестовая сыворотка является отрицательной, если она не образует специфическую линию с антигеном и сгибает линию контрольной сыворотки. Могут появиться неспецифические линии; они не сливаются и не отклоняют линии, сформированные положительным контролем. Тестовая сыворотка является слабоположительной, если она сгибает линию контрольной сыворотки по направлению к лунке с антигеном, не образуя при этом видимой линии преципитации с антигеном; реакция считается неубедительной, если в результате считывания не ясно каков результат, положительный или отрицательный. Тест считается недействительным, если контроли не дают ожидаемых результатов. Можно концентрировать сыворотки, дающие неоднозначные или слабоположительные результаты, и провести повторное тестирование.
С. ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИНАМ
Несмотря на успехи в исследованиях экспериментальных вакцин, в продаже по-прежнему отсутствуют вакцины для контроля энзоотического лейкоза КРС.
|
|
|
