 |
2.1.1. Блокирующий твердофазный иммуноферментный анализ – ИФА сыворотка
|
|
|
|
2. 1. 1. Блокирующий твердофазный иммуноферментный анализ – ИФА сыворотка
Описанный метод подходит для обнаружения антител как в единичных, так и в объединенных образцах сыворотки.
2. 1. 1. 1. Процедура тестирования
i) Сенсибилизация планшета
Все лунки покрывают антителом к вирусу лейкоза КРС, заранее разведенным в буфере для сенсибилизации (100 µл/лунка), планшет запечатывают и инкубируют в течение 18 часов при температуре 4º С. Проводят процедуру промывки (стандартная промывка), которая представляет собой три цикла промывки путем заполнения лунок до краев с замачиванием на 3 минуты между промывками, затем планшет промакивают. Добавляют антиген вируса лейкоза КРС, заранее разбавленный в промывочном буфере (100 µл/лунка), планшет запечатывают и инкубируют в течение 2 часов при температуре 37º С. Проводят цикл стандартной промывки.
ii) Подготовка и добавление образцов и контролей
Положительные и отрицательные контрольные сыворотки заранее разводят (1/2) в промывочном буфере и раствор добавляют в четыре лунки на один контроль (100 µл/лунка). Для исследования объединенных образцов можно объединить 80 сывороток, развести (1/2), используя промывочный буфер, и затем раствор добавляют в две лунки (100 µл/лунка) на образец. Единичные образцы разводят 1/100, используя промывочный буфер, и затем раствор добавляют в две лунки (100 µл/лунка) на образец. После распределения образцов по лункам планшет запечатывают и инкубируют в течение 18 часов при температуре 4º С. Планшет быстро промывают путем заполнения лунок и их немедленного опустошения.
iii) Подготовка и добавление конъюгатов и субстрата
Предварительно разведенное биотинилированное антитело добавляют в лунки (100 µл/лунка) – предварительно разбавляют, используя промывочный буфер + 10% фетальную телячью сыворотку – планшет запечатывают и инкубируют на качающемся столе в течение 1 час при температуре 37º С. Проводят процедуру стандартной промывки, как описано выше. Авидин, конъюгированный с пероксидазой, предварительно разводят в промывочном буфере и раствор добавляют в лунки (100 µл/лунка). Планшет запечатывают и инкубируют на качающемся столе в течение 30 минут при температуре 37º С. Проводят процедуру стандартной промывки. Во все лунки планшета добавляют по 100 µл субстрата ортофенилендиамина, планшет покрывают и оставляют в темном месте на 9 минут. Реакцию останавливают с помощью 0, 5М серной кислоты (100 µл/лунка).
|
|
|
2. 1. 1. 2. Считывание и интерпретация результатов
ИФА ридер обнуляют вхолостую и затем считывают абсорбцию при длине волны в 490 нм. Для ридеров с двойной длиной волны используют референтный фильтр между 620 нм и 650 нм. Результаты считывают в течение 60 минут после добавления стоп-раствора.
Абсорбция отрицательного контроля должна составлять 1, 1 ± 0, 4; если абсорбция ниже 0, 7 – необходимо увеличить время проявления цвета, описанного в этапе iii выше (подготовка и добавление конъюгатов и субстрата). Наоборот время необходимо сократить, если абсорбция превышает 1, 5. Абсорбция положительного контроля должна быть ниже, чем абсорбция отрицательного контроля × 0, 25.
Образец является положительным, когда абсорбция каждой из двух тестовых лунок идентична или ниже средней абсорбции четырех отрицательных лунок × 0, 5.
Образец является отрицательным, когда абсорбция каждой из двух тестовых лунок идентична или выше средней абсорбции четырех отрицательных лунок × 0, 65.
Если четыре образца дают значения между абсорбцией и отрицательным контролем × 0, 5 и × 0, 65 – рекомендуется провести повторное исследование животного, используя образец, отобранный спустя 1 месяц.
|
|
|
2. 1. 1. 3. Чувствительность твердофазного иммуноферментного анализа
Чувствительность ИФА в отношении к объединенным образцам молока можно проверить с помощью слабых положительных и референтных сывороток МЭБ. Исследование должно дать положительный результат на референтные сыворотки МЭБ Е05, разведенные в отрицательном молоке в 250 раз больше, чем количество индивидуальных образцов молока в пуле (Директива ЕС 88/406). Например, для пула из 60 образцов молока Е05 необходимо развести 1/250 × 60 = 1/15000. Что касается индивидуальных образцов молока, положительные референтные сыворотки МЭБ Е05, разведенные 1/250 в отрицательном молоке, должны быть положительными.
При исследовании объединенных образцов сыворотки референтная сыворотка МЭБ Е05 должна быть положительной при разведении в 10 раз превышающем количество индивидуальных сывороток в пуле. Например, для пула в 50 индивидуальных образцов референтная сыворотка МЭБ, разведенная 1/500 в отрицательной сыворотке, должна дать положительный результат. В исследованиях, где образцы сыворотки тестируются отдельно, референтная сыворотка МЭБ Е05, разведенная 1/10, должна быть положительной.
2. 1. 2. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ – ИФА молока
Описанный метод подходит для обнаружения антител в объединенных образцах молока.
|
|
|
