 |
1.2.2. Приготовление образца. 1.2.3. Экстрагирование ДНК. 1.2.4. Процедура гнездовой ПЦР. 1.2.4.1. Метод, разработанный Belak & Bellagi-Pordany (1993)
|
|
|
|
1. 2. 2. Приготовление образца
МКПК отделяют от образцов крови в этилен-диамин-тетрауксусной кислоте (ЭДТК), используя метод разделения фиколл-пак. В качестве альтернативы можно использовать лейкоцитарную пленку или даже цельную кровь, например, когда образцы заморожены.
Опухоли и опухолевые ткани необходимо суспендировать в 10% суспензию.
1. 2. 3. Экстрагирование ДНК
Для достижения оптимальной чувствительности необходимо очистить общую ДНК. Для исследования подходят различные методы очистки, которые свободно имеются в продаже.
Чтобы свести к минимуму риск контаминации в ходе всех этапов следует соблюдать особые меры предосторожности (Belak & Ballagi-Pordany, 1993).
1. 2. 4. Процедура гнездовой ПЦР
Опубликовано несколько протоколов по проведению ПЦР для обнаружения провируснух последовательностей вируса лейкоза КРС (Beier et al., 1998; Rola & Kuzmak, 2001; Teifke & Vahlenkamp, 2008; Venables et al., 1997). В качестве примера приводится подробное описание двух ПЦР, одна из которых была разработана Belak & Bellagi-Pordany et al. (1993), а другая- Fetcher et al., 1996. Участок вируса лейкоза КРС, используемый в качестве цели, - ген gp5 (env). Последовательность, используемая для создания праймеров, доступна в GenBank, номер доступа K02120.
1. 2. 4. 1. Метод, разработанный Belak & Bellagi-Pordany (1993)
i) Строение праймера и последовательности
Размер продукта ПЦРI: 440 пар оснований; Размер продукта ПЦРII: 341 пар оснований; размер продукта-имитатора: 761 пара оснований.
ii) Реакционные смеси
Реакционные смеси смешивают (за исключением образцов ДНК и имитатора) перед добавлением в отдельные реакционные пробирки. На пять образцов необходимо включить один отрицательный контроль (H2O, прошедшая двойную дистилляцию) и один положительный контроль. Общие объемы смесей рассчитывают путем умножения указанных объемов на общее число образцов, включая контроли, плюс один. Полимеразу Taq используют в готовом разведении 1/10.
|
|
|
Образцы ДНК и имитатор1 (Ballagi-Pordany & Belak, 1996) добавляют в отдельных лабораторных помещениях: помещение 1 для приготовлений ДНК и имитаторов, лабораторное помещение 2 для продуктов ПЦРII, чтобы минимизировать риск контаминации.
1 Можно получить у Dr S. Belá k, Шведский университет сельскохозяйственных наук, факультет медико-биологических наук и ветеринарного здравоохранения, почтовый ящик 7063, 750 07 Упасала, Швеция.
a) Реагенты, добавляемые в чистом лабораторном помещении
Данную смесь можно приготовить заранее и хранить при температуре 4º С до 1 месяца.
Следующее необходимо добавить непосредственно перед началом ПЦР
b) Реагенты, добавляемые в лабораторном помещении 1 (ДНК) или 2 (ПЦРII)
iii) Термопрофили ПЦР
Термопрофиль ПЦРI
Термопрофиль ПЦРII
iv) Лабораторная процедура
Реагенты для ПЦРI смешивают, как описано в этапе ii, при добавлении в каждую пробирку образца ДНК используют новые перчатки или открывашку. Образцы помещают на лед. Термоблок нагревают до 80º С. Образцы помещают в термоблок и запускают программу ПЦР (этап iii).
Реагенты для ПЦРII смешивают, как описано в этапе ii, при добавлении в каждую пробирку продукта ПЦРI используют новые перчатки или открывашку Образцы помещают на лед. Термоблок нагревают до 80º С. Образцы помещают в термоблок и запускают программу ПЦРII (этап iii).
v) Электрофорез в агарозном геле
Продукты ПЦРII переносят в помещение, где проводят электрофорез. Примерно 10-15µл образцов и 23µл загрузочного буфера загружают на 2% агарозный гель, содержащий 0, 01% бромид этидия (в качестве альтернативы имеются более безопасные продукты для визуализации продуктов ПЦР, например, RedSafeTM или GelRedTM). Электрофорез
|
|
|
проводят, используя 0, 5 × Трис/борат/ЭДТК (ТБЭ) буфер, при 90 миллиампер в течение 2 часов. Для контроля размера продуктов амплификации рекомендуется использовать лэддер из 100 пар оснований. Анализ продуктов ПЦР производится с помощью УФ освещения.
vi) Интерпретация результатов
a) Положительные образцы должны иметь продукты ПЦР ожидаемого размера (341 пара оснований), подобно положительному контролю.
b) Отрицательные образцы не должны иметь продуктов ПЦР ожидаемого образца (341 пара оснований), однако продукт-имитатор (144 пары оснований) должен присутствовать.
c) Неясные результаты: исследование необходимо повторить, если положительные контроли (имитатор или внешний положительный контроль) являются отрицательными, или если отрицательный контроль (вода) является положительным.
vii) Подтверждающее исследование
Для подтверждающей идентификации в отношении продуктов ПЦР можно провести секвенирование, гибридизацию с содержащим метку зондом или анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Fetcher et al., 1997).
|
|
|
