 |
Заражение через дыхательные пути (интраназальное заражение)
|
|
|
|
Заражение через дыхательные пути (интраназальное заражение)
Животному, фиксированному на доске, прикладывают к носу кусочек ваты, смоченной эфиром или хлороформом. К заражению приступают после того, как у животного появится состояние легкого наркоза. Зараженный материал с помощью шприца вводят в нос небольшими каплями на глубину 1—1, 5 мм мышам, 2—3 мм крысам, 4 мм кроликам и морским свинкам. Чтобы не поранить слизистые оболочки, для введения материала берут абсолютно тупую иглу.
Заражение в переднюю камеру глаза (интраокулярный метод)
Производится обычно у кроликов под местной анестезией глаза. Затем фиксируют глазное яблоко путем захватывания складки конъюнктивы (кнаружи от верхнего края роговицы) глазным пинцетом. После этого тонкой иглой, смоченной исследуемым материалом, протыкают роговицу у лимба в очень косом направлении и проникают в переднюю камеру глаза на глубину не менее 1 мм. Иглу тотчас же вынимают, а ранка закрывается сама по себе. При правильном введении иглы вытекания влаги из передней камеры быть не должно. Можно также после прокола роговицы продвинуть иглу в центральном направлении до тех пор, пока из просвета иглы не покажется жидкость. Выпустив несколько капель влаги передней камеры глаза, иглу соединяют со шприцем и вводят исследуемый материал (не более 0, 05 мл).
Внутримозговой метод (интрацеребральный)
Применяется чаще у кроликов, крыс и мышей. Техника введения материала кроликам та же, что и при тральном методе, только инъекция производится прямой иглой через твердую мозговую оболочку непосредственно в толщу мозгового вещества.
Доза вводимого материала—0, 2-0, 3 мл. При отсутствии инструментов для трепанации можно произвести заражение в мозг путем прокола черепа через кожу, иглой шприца, несколько сбоку от средней линии в области затылочного бугра. Применяют также после разреза кожи прокол черепа острой канцелярской кнопкой с последующим введением в отверстие иглы шприца.
|
|
|
Кроликов можно также заражать в мозг через sulcus supraorbitalis (без трепанации).
Техника следующая: оператор пригибает к столу левой рукой голову фиксированного помощником животного, а правой производит укол короткой (4—5 мл длины) иглой в заранее прощупанную борозду. Направление при проколе должно быть несколько наклонное к средней линии, а невертикальное (опасность попадания в глазницу). Место укола предварительно выстригают и обрабатывают йодной настойкой. При проколе кожа смещается от середины к sulcus supraorbitalis; после прокола черепное отверстие закрывают кожей. Способ очень удобный и быстрый, животные переносят операцию без наркоза.
У белых мышей и крыс техника внутримозгового введения следующие: животное фиксируют в левой руке, кожу головы оттягивают большим и указательным пальцами к затылку, а мизинцем и безымянным удерживают хвост. Прокол производят через кожу в область темени, латеральне средней линии; место укола предварительно обрабатывают настойкой йода. Материал вводят медленно, во избежание резкого повышения внутричерепного давления.
Внутриплевральный метод
Укол производят с правой стороны в межреберное пространство короткой, тупой иглой.
Содержание животных под опытом
После заражения лабораторные животные носят название «подопытных» животных. Их содержат в особом, изолированном от питомника помещении при лаборатории. Технический персонал вивария обязан обо всех случаях заболевания или падежа немедленно сообщать специалисту, проводившему прививки данным животным. Врач и лаборант ежедневно наблюдают за состоянием привитых ими животных, а также проводят клинические исследования.
|
|
|
Взятие крови у лабораторных животных и ее обработка
Небольшое количество крови получают у кроликов и морских свинок из вен уха, у мышей и крыс—из вен хвоста, а большие количества — из сердца. В особых случаях прибегают к полному, или тотальному, обескровливанию, после которого животное погибает.
Для пункции сердца животных фиксируют к доске брюшком кверху. Шерсть в области груди тщательно выстригают, кожу обрабатывают спиртовым раствором йода и после этого приступают к проколу, который в зависимости от вида животного имеет некоторые различия.
Пункция сердца кроликов. Определяют II пальцем, обработанным спиртом и смазанным спиртовым раствором йода, сердечный толчок, т. е. точку наиболее сильно выраженной пульсации сердца. Обычно она прощупывается в третьем межреберье. Прокол грудной клетки делают в области сердечного толчка на расстоянии 2—4 мм от левого края грудины; иглу ведут в направлении к средней линии на глубину 2—2, 5 см. При попадании иглы в полость сердца рука, в которой находится шприц, начинает ощущать ритмичные толчки, связанные с пульсацией сердца и приподнимающие иглу. Поршень шприца легко выдвигается наружу и в цилиндре его тотчас появляется кровь. Взятие крови должно производиться по возможности быстрее во избежание ее свертывания. По этой же причине шприц и иглу рекомендуется промывать перед опытом стерильным раствором цитрата или оксалата натрия. Взяв необходимое количество крови, быстрым движением, без рывка, вынимают иглу и на месте укола накладывают ватный тампон, пропитанный спиртовым раствором йода. Животному подкожно вводят подогретый до температуры тела стерильный изотонический раствор хлорида натрия или глюкозу в количестве, равном двойному объему взятой крови. Пункцией сердца можно получить у кролика 25—30 мл крови.
Пункция сердца у морских свинок. Кончиками III—IV пальцев левой руки нащупывают сердечный толчок, в направлении которого вертикально на глубину 1, 5—2 см вкатывают иглу, отступя на 1—2 мм от левого края грудины. У морских свинок можно получить таким образом 10—12 мл крови.
|
|
|
Пункция сердца у крыс. Как и в предыдущих случаях, пальпаторно определяют место сердечного толчка. На 1 см выше от установленной точки и на 1—2 мм левее от края грудины делают прокол на глубину 1, 5—2 см, держа иглу вертикально. Одномоментно у крыс можно получить 6—8 мл крови.
Тотальное обескровливание кролика. Вскрывают одну из сонных артерий, расположенных по обеим сторонам трахеи. Для получения стерильной крови руки оперируемого должны быть тщательно вымыты и обработаны спиртом или спиртовым раствором йода, все инструменты предварительно необходимо простерилизовать.
Подготовленного для кровопускания кролика привязывают станку брюшком кверху, фиксируя голову кольцом к штативу. Шерсть на шее тщательно выстригают, кожу дезинфицируют. К носу животного прикладывают кусочек ваты, смоченной эфиром. После того как наступит состояние наркоза, скальпелем делают разрез по средней линии шеи и разводят края раны пинцетом. Сонные артерии проходят по бокам трахеи в яремном желобке между веной и нервом. Сверху артерия прикрыта грудино-подъязычной и грудино-щитовидной мышцами. Поэтому для обнаружения нервно-сосудистого пучка эти мышцы разделяют тупым концом скальпеля или браншами пинцета. Артерию освобождают от окружающей соединительной ткани и подводят под нее две лигатуры. Ближайшую к головке лигатуру завязывают двойным узлом, позади второй лигатуры на расстоянии 0, 3—0, 5 см накладывают пеан. Между лигатурой и пеаном маленькими остроконечными ножницами делают продольный разрез сосуда длиной не более 1, 5—2 мм, вставляя в него канюлю (стеклянную трубочку с оттянутым капилляром, кончик которой скошен и хорошо оплавлен). Кончик вставленной канюли укрепляют второй лигатурой. После этого под резиновую трубку, надетую на расширенную часть канюли, подставляют пробирку или флакон и снимают пеан с артерии, чтобы кровь могла вытекать свободно. Обескровливание морских свинок производят так же, как и кроликов.
Взятие крови из вены уха кролика. Для получения крови из краевой вены нужно, прежде всего, вызвать гиперемию уха, потирая его ладонями рук и слегка ударяя кончиками пальцев. Затем вдоль наружного края уха удаляют пушок и протирают ватой, увлажненной 70% спиртом. Если в результате всех перечисленных процедур сосуды не инъецируются, ухо смазывают ксилолом или толуолом. После того как сосуды набухнут и четко обозначатся на поверхности ушной раковины, наружную поверхность ее покрывают тонким слоем жидкого парафина (во избежание быстрого свертывания крови) и делают прокол вены.
|
|
|
Для получения небольшого количества крови (менее 1 мл) прокалывают одну из небольших периферических ветвей, а для получения больших объемов крови (5—10 мл) вскрывают краевую вену уха. С этой целью иглу шприца вводят в вену почти параллельно поверхности уха, чтобы не повредить противоположную стенку вены. При проколе вены иглой шприца кровь, как правило, выходит отдельными каплями с большими интервалами, и кровотечение прекращается быстро. Для того, чтобы вызвать обильное кровотечение, нужно сделать ранку с рваными краями. С этой целью пользуются обломком тонкого капилляра пастеровской пипетки. При таком способе прокола из уха кролика получают до 30 мл крови. После взятия крови к проколу вены прикладывают на 2—3 минуты кусочек сухой стерильной ваты, не нажимая сильно на стенку сосуда, так как при этом кровотечение может усилиться. Если кровотечение долго не прекращается, хорошие результаты дает нанесение на ранку нескольких капель перекиси водорода.
Взятие крови из вен у морских свинок, крыс и мышей. У морских свинок кровь в количестве 0, 3—0, 5 мл получают после нанесения насечек на край уха или прокола мягких подушек лапы.
У белых крыс и мышей для получения 1—3 капель крови приходится прибегать к ампутации кончика хвоста после продолжительного прогревания его в воде температуры 45—50°С или протирания ксилолом. Взяв кровь, рану прижигают перекисью водорода.
Есть способ, позволяющий получить у крыс 0, 5—1 мл крови из венозного сплетения, лежащего в орбите, позади глазного яблока. Взятие крови производят стеклянной пипеткой с оттянутым капилляром (наружный диаметр 0, 6 мл), острие которого сточено под углом 45°.
Животное берут I и II пальцами левой руки со стороны спины за шею и слегка сдавливают с боков, вызывая легкое выпячивание глаз. Вращательным движением пипетки делают прокол конъюнктивального мешка в медиальном углу глаза между глазным яблоком и орбитой. После прокола пипетку ведут в направлении гортани на глубину 4—5 мм. Попадание в венозное сплетение сопровождается заполнением капилляра пипетки кровью.
|
|
|
Получение дефибринированной крови. Кровь животного сливают в стерильную колбу со стеклянными бусами и непрерывно в течение 10—15 мин встряхивают. В результате встряхивания находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивая бусы, а дефибринированная кровь, слитая в другую колбу или пробирку, утрачивает способность свертываться.
Приготовление взвеси эритроцитов. Для освобождения от пленок фибрина дефибринированную кровь фильтруют через трехслойный марлевый фильтр. Фильтрат наливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 2000—3000 об. /мин. в течение 10—15 минут. Эритроциты оседают на дно пробирки, а прозрачная, слегка желтоватого цвета плазма образует надосадочный слой. После центрифугирования уровень жидкости в пробирке отмечают карандашом, отсасывают плазму пастеровской пипеткой, эритроциты промывают, доливая до метки стерильный изотонический раствор хлорида натрия, и вновь центрифугируют. Промывание эритроцитов с добавлением свежего раствора производят 2—3 разa, чтобы последняя порция промывной жидкости была бесцветна.
Из промытых эритроцитов готовят 3% или 5% взвесь, прибавляя к 3—5 мл эритроцитов соответственно 97—95 мл изотонического раствора хлорида натрия (для получения меньших количеств взвеси объемы обоих ингредиентов уменьшают в одинаковое число раз).
Взвесь эритроцитов можно хранить в холодильнике при температуре 3—4°С в течение 5—6 дней.
Приготовление сыворотки крови. Кровь, собранную в стерильную пробирку, закрывают ватно-марлевой пробкой, ставят на 20—30 мин в термостат или водяную баню, отрегулированную на 37°С, так как в тепле кровь свертывается быстрее и лучше. Во время свертывания сгусток крови обычно прилипает к стенкам пробирки. Поэтому после взятия пробирок из термостата сгусток отделяют от стенок пробирки круговым движением капилляра стерильной пастеровской пипетки или стеклянной стерильной палочкой.
После отделения сгустка сыворотку ставят в холодильник при температуре 3—4°С. В течение 3—4 ч сыворотка обычно отделяется полностью, и ее можно отсосать стерильной пастеровской пипеткой. Для того чтобы во время отсасывания содержимое пробирки было хорошо видно, пастеровскую пипетку соединяют со стеклянной трубкой — «мундштуком» (резиновая трубка длиной 20—25 см). При отсасывании кончик пипетки не должен соприкасаться со сгустком крови, чтобы в сыворотку не попали эритроциты.
Окрашенную в розовый цвет сыворотку центрифугируют при 2000—3000 об. /мин. в течение 10—15 мин для осаждения форменных элементов крови.
При взятии крови вскоре после кормления животных, а также при повторных кровопусканиях с короткими интервалами возникает иногда липемия, т. е. появление избытка жировых веществ в крови. Сыворотки, получаемые во время липемии, бывают мутные (хилезные), иногда опалесцирующие, и это очень затрудняет чтение диагностических реакций, особенно реакции преципитации. Во избежание получения мутных сывороток кровь у животных берут натощак. Просветление липемической плазмы наступает также при введении в кровеносное русло животного гепарина, способствующего повышению концентрации в крови фермента, называемого фактором просветления. С этой целью кроликам весом 2—2, 5 кг в краевую вену уха вводят за 1—1, 5 ч до обескровливания 60 мг гепарина.
Форменные элементы из крови удаляют центрифугированием. В слитой с осадка плазме через короткое время после центрифугирования образуется сгусток фибрина, который уплотняется при перемешивании крови стеклянной палочкой. Затем этот сгусток удаляют. В некоторых случаях фибрин из плазмы выпадает не полностью. Для удаления остатков фибрина и выявления полноты его удаления к сыворотке прибавляют несколько капель тромбина. Освобожденную от фибрина сыворотку фильтруют через асбестовые фильтры. Полученная таким способом сыворотка совершенно прозрачна и не имеет признаков опалесценции.
Приготовление цитратной крови. Полученную из сердца или вены кровь сливают в пробирку с 5% раствором цитрата натрия (10 мл крови, 1 мл цитрата натрия). Цитратная кровь не свертывается.
Приготовление плазмы крови. Цитратную кровь ставят на 18—20 ч в холодильник или подвергают центрифугированию. В результате над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета—плазмы.
|
|
|
