 |
ТЕМА 3. бактериологический метод: техники пересева чистой культуры
|
|
|
|
Получив изолированные колонии, из колоний с различной характеристикой или содержащих различные по форме и окраске бактерии делают пересев бактерий. Выделяют следующие техники пересева:
Техника посева проб в пробирки со скошенной средой
Обычно на скошенные среды переносят культуру с колоний на чашках. Для этого необходимо приподнять крышку чашки Петри и стерильной петлёй прикоснуться к колонии. После этого в левую руку берут пробирку со скошенным агаром (между большим и указательными пальцами) так, чтобы поверхность скошенного агара была перед глазами. Пробирку открывают над пламенем горелки, обжигают её край, а затем петлю вводят в пробирку до дна, где имеется небольшое количество конденсационной воды. Плоской поверхностью петли прикасаются к поверхности агара и делают посев штрихообразными движениями, постепенно продвигаясь снизу вверх. Обжигают в пламени край пробирки и пробку, закрывают пробирку над пламенем.
Техника посева в жидкую среду
Простерилизованной бактериологической петлей отбирают материал, наносят его на стенку пробирки у верхнего уровня среды и, слегка встряхивая пробирку, смывают его средой. Край пробирки и пробку обжигают, быстро закрывают.
Техника посева бляшкой
При определении некоторых свойств исследуемых культур бактерий на плотных средах производят плотный посев на ограниченном участке среды в виде прямоугольника, овала, круга размерами 0,5 – 0,8 х 1 – 1,5 см. Между бляшками следует выдерживать расстояние в несколько см.
Техника посева в конденсационную воду
Выбирают свежескошенную среду, содержащую на дне каплю конденсационной жидкости. Исследуемую культуру забирают петлей и вносят в конденсационную воду. У выражено подвижных культур рост бактерий с конденсационной воды распространяется на влажную поверхность скошенной среды. С верхней части роста бактерий производят пересев в конденсационную воду второй пробирки и т. д. Методика позволяет получить чистую культуру подвижных бактерий (например, протея, возбудителя столбняка).
|
|
|
Техника посева в верхнюю часть скошенной среды
Материал наносят в виде бляшки на верхнюю часть свежескошенной среды. Пробирки помещают в термостат в вертикальном положении и наблюдают за сползанием культуры вниз по поверхности скошенной части, которое характерно для слизистых штаммов.
Техника посева уколом в столбик плотной или полужидкой среды
Используют высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, полускошенные плотные среды. Во всех случаях бактериальной петлей или иглой с посевным материалом делают прокол среды с поверхности до дна. Пробирку рекомендуют держать дном вверх, чтобы не наступила контаминация среды воздушной микрофлорой.
После инкубации изучают изолированные колонии. Колонии обладают набором определенных признаков:
а) размеры – большие (диаметр более 4 – 5 мм), средние (диаметр 2 – 4 мм), мелкие (диаметр менее 1 – 2 мм) и микроскопические (диаметр менее 1 мм);
б) цвет – белый, жёлтый, сине – зелёный, бурый, чёрный, цвет среды и др.;
в) форму – круглая, лаптеобразная, розеткообразная и др.;
г) края – ровные, волнистые, зазубренные, отростчатые и др.;
д) поверхность – гладкая, шероховатая, блестящая, матовая, плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная и др.;
е) консистенция – сухая, пастообразная, слизистая, однородная, зернистая;
ж) прозрачность – прозрачная, мутная.
Для определения морфологии клетки и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму. Оставшуюся часть колонии отсевают на скошенный питательный агар.
|
|
|
Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых сводится к удалению кислорода из среды. Условия анаэробиоза создают различными способами:
1. Физические:
а) удаление воздуха при помощи насоса из герметически закрывающегося прибора – анаэростата;
б) удаление воздуха из среды при помощи кипячения с последующим быстрым охлаждением и заливкой среды стерильным вазелиновым маслом;
в) внесение в жидкую питательную среду кусочков печени, мяса, почки, которые поглощают кислород;
г) посев в высокий столбик агара, который затем заливается слоем вазелинового масла для предотвращения доступа воздуха;
д) использование трубок Вейон – Виньяля: в стеклянную трубку длиной около 30 см и диаметром 3 – 4 мм насасывают расплавленный агар, засеянный микробами, трубку запаивают с обоих концов, для выделения колоний у нужного места трубку надламывают и производят отсев бактерий.
2. Химические:
а) добавление в питательную среду веществ, редуцирующих кислород (например, глюкозу, глутатион, пировиноградную кислоту и др.);
б) добавление в атмосферу роста химических веществ, поглощающих кислород (например, щелочного пирогаллола).
3. Биологический (метод Фортнера): совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов на кровяном агаре с глюкозой в запаранифинированной чашке Петри.
ЗАДАНИЕ
1. Изучить колонии на чашках: определить размеры колоний, форму, поверхность, характер края, прозрачность колонии, наличие пигмента, консистенцию. Из части колонии приготовить мазок, окрасить по Граму, микроскопировать. Зарисовать и записать морфологию бактерий.
2. Отсеять оставшуюся часть колонии используя различные техники пересева.
3. Ознакомиться с методами создания анаэробиоза.
Контрольные вопросы
1. Какие существуют техники пересева бактерий?
2. Какие признаки колоний имеют дифференциальное значение?
3. Какую роль играют пигменты бактерий?
4. Почему пигмент у одних бактерий окрашивает только колонии, а у других – колонии и питательную среду?
5. Физические способы создания анаэробиоза.
6. Химические методы создания анаэробиоза.
7. Биологический метод создания анаэробиоза.
|
|
|
