 |
ТЕМА 1. биологический метод исследования
|
|
|
|
Инфекция – совокупность патологических, адаптационно – приспособительных и репаративных реакций организма, возникающих в результате его конкретного взаимодействия с патогенными и при определенных условиях условно – патогенными вирусами, бактериями и грибами. Аналогичные процессы, вызванные простейшими, называют инвазиями.
Биологический (экспериментальный) метод исследования состоит в искусственном воспроизведении клинической картины инфекционных болезней на лабораторных животных. В практической микробиологии его используют для диагностики инфекционных болезней, выделения и идентификации чистой культуры возбудителя, индикации и идентификации экзотоксинов. Кроме того, его широко применяют в экспериментальной микробиологии и иммунологии, а также для контроля иммунопрепаратов.
Биологический метод исследования используют в тех случаях, если другие методы неэффективны и если имеются необходимые условия для содержания лабораторных животных. Метод включает заражение животного, наблюдение за ним, вскрытие погибшего или забитого животного.
Материал для заражения должен быть забран в асептических условиях, в стерильную посуду, гомогенизирован, использован возможно быстрее. Способ заражения зависит от типа материала, вида животного, предполагаемого повреждающего агента. Материал может быть введён накожно, подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, через нос, рот и прямую кишку, в сердце, желудок, мозг, в вагину, яичко, конъюнктиву, в суставные полости. Перед заражением с операционного поля необходимо удалить шерсть и обработать его 70 % этанолом с последующим смазыванием настойкой йода.
|
|
|
При наблюдении за зараженными животными отмечается вялость, отсутствие аппетита, понос, различные двигательные нарушения. В этот период животные должны быть обеспечены полноценным питанием, доброкачественной питьевой водой, предохранены от простуды, перезаражения.
В случае гибели животного или его умерщвления проводят микробиологическое исследование трупа. Вскрытие производят в асептических условиях: мелких животных – в кюветах на парафиновой пластинке, крупных – на специальных операционных столиках. Целью бактериологического исследования трупа является обнаружение микроба, содержавшегося во введенном материале, определение места его локализации в организме и выделение чистой культуры возбудителя.
ЗАДАНИЕ
1. Заразить белых мышей исследуемым материалом подкожно и внутрибрюшинно, проведя предварительное обезболивание. Для чего животное поместить до засыпания в закрытый стеклянный сосуд, в котором находится вата, смоченная эфиром или хлороформом.
Подкожный способ заражения
Приподкожном введении исследуемого материала фиксировать животное, протереть место инъекции кусочком ваты, смоченной в спирте, захватить в складку кожу на спине у корня хвоста, ввести в неё иглу примерно до половины, медленно ввести 0,5 мл материала, отпустить складку. Затем иглу быстро извлечь, прикрыв место инъекции ватой, смоченной спиртом.
Внутрибрюшинный способ заражения
Животное фиксировать головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. После обработки спиртом места инъекции в левой нижней трети живота проколоть кожу, держа иглу под острым углом, затем перевести шприц в положение, перпендикулярное брюшной стенке, толчкообразным движением проколоть брюшину и ввести содержимое шприца. Извлечь иглу, прикрыв место инъекции ватой, смоченной в спирте.
2. Произвести вскрытие погибших белых мышей. Вскрытие и исследование трупа животного делят на 3 этапа:
|
|
|
а) вскрытие и исследование наружных покровов
Закрепить труп животного животом кверху, положив его на кусочек марли, смоченной дезинфицирующим раствором. Обработать шерсть и кожу ватным тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором. Стерильными инструментами сделать разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы вдоль конечностей. Отсепарировать кожу, отметить состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов. При обнаружении измененных узлов произвести из них посевы на питательные среды и сделать мазки – отпечатки на предметных стёклах.
б) вскрытие и исследование грудной полости
Вскрыть грудную полость, для чего сделать разрез в диафрагме, ввести в него браншу ножниц, перерезать рёбра с обеих сторон от грудины, откинуть вырезанный лоскут кверху, осмотреть органы грудной полости. При наличии экссудата сделать из него посевы и мазки. Для взятия крови из сердца прижечь пинцетом участок его, проколоть этот участок стерильной пастеровской пипеткой, набрать несколько капель крови, произвести посев и приготовить мазок. Сделать посев из ткани лёгкого и мазки – отпечатки из него.
в) вскрытие и исследование брюшной полости
Вскрыть брюшную полость, осмотреть её органы, обратить внимание на наличие экссудата, величину и цвет печени, селезёнки, мезентериальных лимфатических узлов. Произвести посевы из печени, селезёнки, почек, лимфоузлов и приготовить мазки – отпечатки этих органов. Для этого вырезать из ткани органа небольшие кусочки, взять пинцетом и прикоснуться к поверхности агара в соответствующем участке чашки Петри (рис. 2), а затем к предметному стеклу. По окончании вскрытия завернуть труп в подложенную под него марлю.
 |
Рис. 2. Схема посева из органов белой мыши
3. Зафиксировать приготовленные мазки – отпечатки над пламенем, окрасить водным фуксином или метиленовым синим, а также по Граму, микроскопировать.
Контрольные вопросы
1. Чем характеризуется инфекция?
2. Какие периоды болезни выделяют при манифестной инфекции?
3. Дайте характеристику признакам микроорганизма, определяющим развитие инфекции.
4. Какими факторами определяется вирулентность микробов?
|
|
|
5. Что представляют собой ферменты агрессии?
6. Каков химический состав и механизм действия бактериальных токсинов?
7. В чём состоят различия между бактериальными экзо – и эндотоксинами?
8. Чем определяются инфекционные свойства вирусов и каковы особенности вирусных инфекций?
9. Каковы пути распространения микробов в организме?
10. В чём различие между бактериемией и септицемией?
11. В чём состоит биологический (экспериментальный) метод исследования?
12. Каковы методы экспериментального заражения животных?
13. Каков порядок вскрытия лабораторных животных?
14. Какими методами определяют наличие ферментов агрессии и гемолитической способности бактерий?
ТЕМА 2. биологический метод исследования:
ФОРМЫ ИНФЕКЦИИ
Формы инфекции, в зависимости от свойств главных факторов инфекционного процесса (т. е. возбудителя и макроорганизма), принято разделять на две основные группы:
1) манифестная инфекция, которая протекает при наличии характерного симптомокомплекса, включает:
· типичную для данного возбудителя форму инфекции, когда возбудитель проникает в организм, активно в нём размножается, вызывая типичные для данной болезни клинические проявление;
· атипичную форму, когда возбудитель проникает в организм, активно в нём размножается, организм отвечает соответствующими иммуно – биологическими реакциями, которые приводят к формированию активного иммунитета, но клинические симптомы болезни носят невыраженный, стёртый или атипичный характер;
· персистентную (хроническую) форму, когда возбудитель проникает в организм, размножается в нём, вызывает активную форму болезни, но под влиянием иммунных систем организма и химиопрепаратов подвергается L – трансформации. L – формы бактерий могут длительное время персистировать в организме. Возвращаясь в свою исходную форму, возбудитель вызывает рецидив болезни (например, туберкулёз);
· медленные инфекции, когда возбудитель проникает в организм и может долгое время сохраняться в нём внутриклеточно в латентном состоянии. При благоприятных для возбудителя условиях он начинает размножаться, заболевание протекает всё тяжелее и тяжелее и, как правило, заканчивается смертью больного (например, СПИД);
|
|
|
2) бессимптомная инфекция, которая протекает без выраженных симптомов, включает:
· абортивную форму инфекции, когда возбудитель проникает в организм, но не размножается в нём. Инфекционный процесс обрывается, и возбудитель рано или поздно погибает или удаляется из организма;
· латентную форму, когда возбудитель проникает в организм, размножается в нём, макроорганизм отвечает на него соответствующими иммунобиологическими реакциями, ведущими к формированию приобретенного иммунитета и удалению возбудителя из организма. Однако никаких внешних клинических проявлений этой инфекции нет, она протекает скрыто (например, полиомиелит, бруцеллёз, некоторые вирусные гепатиты);
· дремлющую инфекцию, когда бессимптомное пребывание возбудителя в организме может сохраняться долгое время после латентной инфекции или после перенесенного заболевания. Патогенные микробы находятся некоторое время как бы в «дремлющем» состоянии. Под влиянием условий, понижающих сопротивляемость организма, микроорганизмы активизируются и вызывают заболевание или его рецидив (например, заглохший воспалительный процесс в кариозном зубе);
· бактерионосительство, когда после либо латентной инфекции, либо перенесенного заболевания организм в состоянии полностью освободиться от возбудителя. Бактерионосители, являясь источником заражения, играют большую роль в эпидемиологии многих заболеваний (например, брюшного тифа, дифтерии).
ЗАДАНИЕ
1. Зарегистрировать результаты определения ферментов агрессии (коагулазы, фибринолизина), гемолитической способности бактерий.
Определение клеточной коагулазы
В капле густой суспензии исследуемой культуры на предметном стекле размешать каплю цельной цитратной плазмы кролика или человека. В положительных случаях через несколько секунд образуется сгусток. Одновременно поставить заведомо положительный и заведомо отрицательный контроль.
Пробирочная реакция установления свободной коагулазы
В 1 мл цитратной плазмы кролика или человека, цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором, размешать по петле 18 – 24 – часовой агаровой культуры. Смесь вместе с заведомо положительным и заведомо отрицательным контролями инкубировать при 370С и контролировать на появление сгустка через 2 – 4 – 18 ч. дальнейшая инкубация свёрнутой плазмы может привести к расплавлению сгустка, что свидетельствует о фибринолитической активности исследуемой культуры.
|
|
|
Определение гемолитической активности
Приготовить кровяной агар, для чего к расплавленному и охлажденному до 450С 2 % МПА добавить 5 – 10 % подогретой стерильной крови барана, кролика или человека, смешать и разлить по чашкам Петри, выдержать сутки в термостате на возможно бактериальную контанацию. Исследуемую культуру засеять штрихом или бляшкой. Гемолиз проявляется в виде зон просветления вокруг колоний или бляшек роста.
Контрольные вопросы
1. Какие формы манифестной инфекции вам известны?
2. Какие формы бессимптомной инфекции вам известны?
3. Какими методами определяют наличие ферментов агрессии у бактерий?
4. Какими методами определяют наличие гемолитической способности бактерий?
Рекомендуемая для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям литература:
1. Адо А.Д. Общая аллергология.-М.2007.
2. Борисов Л.В., Смирнова А.М., Фрейдлин М.С. Медицинская микробиология.-М.1994.
3. Воробьев А.А. Микробиология.-М.2001.
4. Коротяев А.И., С.А.Бабичев Медицинская микробиология, иммунология и вирусология.-СПб.-«Специальная литература».-2012.
5. Красильников А.П. Микробиологический справочник.-Минск.-2009.
6. Медицинская микробиология (под редакцией В.И. Покровского) –М.2011.
7. Медицинская вирусология (под редакцией Королюка А.М.)- Санкт-Петербург.-2003.
|
|
|
