Cоставитель: доцент Л.П.Лисишникова

2012г.

 

Тема занятия №7: Рост, размножение и дыхание бактерий. Бактериологический метод диагностики. Методы культивирования анаэробов

Цели и задачи: Ознакомить студентов с фазами роста и размножения бактерий. Изучить классификацию бактерий по типам дыхания. Рассмотреть методы культивирования анаэробов.

Основные понятия, которые должны быть усвоены студентами в процессе изучения темы: культивирования анаэробов, микроаэрофилы, облигатные анаэробы, облигатные аэробы, факультативные анаэробы, фазы роста и размножения.

План занятия

1. Рост, размножение и дыхание бактерий.

2. Бактериологический метод диагностики

3. Методы культивирования анаэробов

 

 

ФАЗЫ РОСТА И РАЗМНОЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ.

Основным способом размножения бактерий является поперечное деление. Для получения бактериальной популяции достаточно наличия в определенной питательной среде одной бактерии, которая при подходящих условиях за определенный период времени образует большое количество поколений клеток. Размножение бактерий происходит в несколько стадий:

1. фаза -lag-фаза, количество бактерий не изменяется, продолжительность 4 часа (период адаптации, происходят различные биохимические процессы).

2. фаза - логарифмического роста, бактерии энергично размножаются, количество клеток возрастает в геометрической прогрессии. Отмечается наибольшая биохимическая и биологическая активность, продолжительность 5-6 часов.

3. фаза - стационарная - число вновь образующихся клеток равно числу отмирающих, продолжительность 2 часа.

4. фаза - ускоренной гибели, процессы гибели клеток преобладают над размножением, продолжительность 3 часа.

5. фаза - логарифмической гибели - отмирание клеток нарастает, продолжительность 5 часов.

6. фаза - покоя, обмен веществ замедляется, анабиоз.

Атмосферный воздух содержит-78% азота, 20% кислорода и 0,03—0,09% углекислого газа. Углекислота и азот воздуха могут быть использованы только аутотрофами. Кислород же играет важную роль в метаболизме (обмене веществ), дыхании и получении энергии большинства видов бактерий. Дыхание (или биологическое окисление) — это сложный процесс, который сопровождается выделением энергии, необходимой микроорганизмам для синтеза различных органических соединений. Бактерии, как и высшие животные, для дыхания используют кислород. Однако Л. Пастером было доказано существование таких бактерий, для которых наличие свободного кислорода является губительным, энергия, необходимая для жизнедеятельности, получается ими в процессе брожения. Все бактерии по типу дыхания подразделяются на облигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы.

Облигатные (строгие) аэробы развиваются при наличии в атмосфере 20% кислорода (микобактерии туберкулеза), содержат ферменты, с помощью которых осуществляется перенос водорода от окисляемого субстрата к кислороду воздуха.

Микроаэрофилы нуждаются в значительно меньшем количестве кислорода, и его высокая концентрация хотя и не убивает бактерии, но задерживает их рост (актиноисцеты, бруцеллы, лептоспиры).

Факультативные анаэробы могут размножаться как в присутствии, так и в отсутствие кислорода (большинство патогенных и сапрофитных микробов — возбудители брюшного тифа, паратифов, кишечная палочка).

Облигатные анаэробы — бактерии, для которых наличие молекулярного кислорода является губительным (клостри-дии столбняка, ботулизма).

Аэробные бактерии в процессе дыхания окисляют различные органические вещества (углеводы, белки, жиры, спирты, органические кислоты и пр.).

Дыхание у анаэробов происходит путем ферментации субстрата с образованием небольшого количества энергии. Процессы разложения органических веществ в безкислородных условиях, сопровождающиеся выделением энергии, называют брожением. В зависимости от участия определенных механизмов различают следующие виды брожения: спиртовое, осуществляемое дрожжами, молочно-кислое, вызываемое мол очно-кислыми бактериями, масляно-кислое и пр.

С выделением большого количества тепла при дыхании некоторых микроорганизмов связаны процессы самовозгорания торфа, навоза, влажного сена и хлопка.

Культивирование анаэробов

Культивирование анаэробов требует специальных условий, т.к. эти микробы необходимо лишить доступа свободного кислорода. В питательные среды, используемые для посева анаэробов, добавляют вещества, которые поглощают кислород из среды и снижают его концентрацию: глюкозу 1-2%, аскорбиновую кислоту – 0,08%. Все питательные среды перед посевом регенерируют, т.е. кипятят на водяной бане не менее 15 минут и быстро охлаждают, удаляя, таким образом, воздух, содержащийся в среде. Среду после посева заливают слоем вазелинового или парафинового масла, чтобы предупредить доступ кислорода. Культивируют анаэробы в бескислородных условиях. Существует несколько способов удаления кислорода: механический, химический, биологический.

Механический способ

а) Удаление воздуха механическим путем. Удаление воздуха
(а, следовательно, и кислорода) проводят в специальных приборах - анаэростатах путем выкачивания. Этот прибор может быть заменен эксикатором.

б) Механическая защита от кислорода воздуха. Делают посев по
методу Вейон-Виньяля в пастеровских пипетках. Для посева в чашках
делают посев по методу Перетца, для этого разведения исследуемого
материала в расплавленном агаре выливают в чашки Петри, на дно которых положены на стеклянные палочки или спички стерильные стеклянные
пластинки. Между дном чашки и стеклянной пластинкой образуется капиллярная полость, куда расплавленный агар быстро затекает. Высота слоя агара под стеклом 1-2 мм, в этом слое вырастают анаэробы, в то время как над стеклом растут аэробы.

в) Замена воздуха индифферентным газом. В этом случае в анаэростат после откачивания воздуха нагнетают азот или, присоединив анаэростат к аппарату Киппа, вытесняют воздух с кислородом образующимся водородом.

г) Наиболее простой способ - посев уколом в высокий столбик
сахарного агара.

Химический способ

Основан на способности некоторых веществ (щелочной раствор пирогаллола, гидросульфит натрия), поглощать кислород из воздуха. Засеянные чашки, или пробирки помещаю в специальные аппараты: Аристовского, 0мелянского или микроанаэростат, эксикатор, туда же помещают погло­щающие вещества в чашке Петри, аппарат плотно закрывают.

Биологический способ

Основан на совместном выращивании в чашке анаэробов и аэробов-метод Фортнера. После посева чашки закрывают, заливают парафином для герметичности. Выросшие аэробы используют кислород и создают бескис­лородные условия для роста анаэробов.

В некоторых случаях, когда не требуется низкого парциального давления кислорода, кислород из воздуха можно удалить, поместив в эксикатор горящую свечу.

Среды и аппаратура для культивирования анаэробов

Среда Китта-Тароцци – представляет собой питательный бульон с 0,5% глюкозы, в который погружены кусочки печени или мяса. Перед посевом среду кипятят 20 мин, быстро остужают до 45° С и засевают сразу же, после посева в пробирку на поверхность среды наливают стерильное вазелиновое масло, чтобы защитить посев от кислорода.

Анаэростат – прибор, служащий для создания и поддержания ста­бильно анаэробных условии. Промышленность изготовляет микроанаэростаты и макроанаэростаты.

Микроанаэростат – представляет собой толстостенный металличес­кий стакан цилиндрической формы, который через вакуумную резиновую прокладку закрывают металлической крышкой. Но крышке расположены вакуумметр и патрубок для откачивания и нагнетания воздуха и газа. Крышку прижимают к краям стакана винтом с дугообразным хомутом.

Макроанаэростат – это водяной термостат, внутри которого вмонтирован анаэростат – толстостенный металлический котел цилиндрической формы, герметически закрывающийся крышкой со стеклом для наблюдения за ростом микробов. На верхней стенке анаэростата находятся вакуумметр и патрубок для откачивания воздуха. Рабочая камера имеет съемные полочки для чашек и пробирок. В макроанаэростате вакуум должен быть доведен до 3-10 мм ртутного столба.

Эксикатор – стеклянный толстостенный сосуд, закрывающийся крышкой, которую можно притереть к краям эксикатора. В крышке имеется патрубок с краном для откачивания или нагнетания воздуха.

Посев по Фортнеру. Кровяной питательный агар разливают в чашки Петри толстым слоем, после застывания по диаметру агар вырезают в виде узкой щели. На одну половину чашки засевают культуру аэробного микроба, жадно поглощающего кислород (кишечную палочку, чудесную палочку), а на другую половину засевают исследуемый материал. Чашку закрывают, заливают парафином. Аэробные бактерии быстро используют кислород воздуха в герметически закрытой чашке, затем начинают размножаться анаэробы, через 24-48 часов чашку открывают и из отдельных колоний анаэробов выделяют чистую культуру.

Посев по Вейон-Виньялю в пастеровских пипетках. Пастеровские пипетки представляют собой длинные трубки (20-25 см) диаметром около 5 мм, приготовленные из легкоплавкого стекла. Один конец пипетки открыт, а другой вытянут в виде капилляра и запаян. Перед стерилизацией в широкий конец вставляют вату. Исследуемый материал разводят полужидким агаром с небольшим содержание глюкозы, затем из каждого разведения насасывают агар в стерильную пастеровскую пипетку, предварительно обломив запаянный конец капилляра, и избегая попадания пузырьков воздуха. Затем капилляр запаивают и пипетки помещают в термостат. Через 24-48 часов в среде можно обнаружить ясно видимые колонии бактерий в виде пушинок, комочков ваты, зерен чечевицы и т.д. Нужные колонии можно извлечь, распилив трубку.

 

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА.

 

Заполнить схемы и таблицы.

 

Фазы роста микроорганизмов:

 

1. ________________________ 5. ________________________

2. ________________________ 6. ________________________

3. ________________________

4. ________________________

⇐ Предыдущая12345Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: