Сроки выдачи и формулировка ответов

Ответ при исследовании на коклюш и паракоклюш выдается, как правило, на 4—6 дни. Предварительный положительный ответ может быть выдан на 4 день с формулировкой: «Обнаружены микробы, подозрительные на бактерии рода бордетелла, исследование продолжается». Окончательный положительный ответ может быть выдан на 5—6 дни и формулируется: «Обнаружены B. pertussis (B. parapertussis, B. bronchi­ septica)». Отрицательный ответ выдается на 6 день при отсутствии подозрительных колоний для бактерий рода бордетелла и формулируется: «Коклюшные (паракоклюшные, бронхисептические) микробы не обнаружены». В случае замедленного роста микробов или выделения нетипичной культуры предварительный и окончательный ответы могут быть выданы позже (7—8 дни).

6.4. Материалы и оборудование

Сваб-система (стерильный зонд-тампон алюминий / вискоза в пробирке) без наполнителя или тампоны, приготовленные в лаборатории

Бинокулярный стереоскопический микроскоп или бинокулярная лупа с большим фокусным расстоянием

Термостат, поддерживающий температуру (36 ± 1) °С

Чашки Петри стеклянные                                         ГОСТ 23932—90

или пластиковые

Петли микробиологические

Пипетки                                                                          ГОСТ 29227—91

Пробирки бактериологические                               ГОСТ 25336—82

Кровь баранья дефибринированная для
питательных сред

Казеиново-угольный агар (КУА)                           ФС 42-3671—98

Пенициллин или цефалексин (Bordetella selective supplement)

Сыворотка крови крупного рогатого скота жидкая

Питательная среда 199 стерильная жидкая

Набор для окраски мазков по Граму

Набор для микроскопии:

стекла покровные для микропрепаратов   ГОСТ 6672

стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 9284

иммерсионное масло                                        ГОСТ 13739—78

Агар микробиологический                                       ГОСТ 17206—84

Среда Симмонса

Бульон мясопептонный (бульон Хоттингера)    ТУ 10-02-789-176—94

Мочевина                                                                      ГОСТ 6691—76

Крезоловый красный                                                 ТУ 6-09-5207—85

Сыворотка диагностическая коклюшная агглютинирующая сухая ФС 42-3876—99

Сыворотка диагностическая паракоклюшная агглютинирующая сухая   ФС 42-3875—99

Сыворотки к агглютиногенам (факторам) 1, 2, 3 кок­люшного микроба и 14 – паракоклюшного микроба                                                                                ФС 42-3584—98

7. Полимеразная цепная реакция

Обнаружение ДНК Bordetella pertussis, ДНК Bordetella parapertus­ sis, ДНК Bordetella bronchiseptica проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Суть метода состоит в многократном копировании (амплификации) специфических участков ДНК искомых бактерий, в процессе повторения от 35 до 45 раз запрограммированных циклов, состоящих из трех (как правило) режимов температуры, удерживаемой определенное время. Амплификация участков ДНК происходит на специальном оборудовании (амплификаторах) с помощью термостабильного фермента Taq-полимеразы, который достраивает нуклеотидную последовательность после коротких олигонуклеотидов (праймеров), комплементарно связывающихся с искомым участком ДНК.

На первом этапе анализа проводится обработка исследуемого биологического материала с целью экстракции (выделения) ДНК возбудителя и удаления или нейтрализации ингибиторов реакции амплификации. С целью обеспечения качества выполнения процедуры исследования, для каждого образца целесообразно использовать внутренний контрольный образец, который добавляется в биологический образец на этапе экстракции ДНК. На втором этапе проводится собственно амплификация фрагмента ДНК искомого микроорганизма и далее визуализация (детекция) результата. Последний этап – детекция фрагментов амплификации может проводиться различными методами. Более дешевым методом является метод электрофореза в агарозном геле, однако этот способ сопряжен с повышенным риском контаминации лаборатории фрагментами ПЦР, что может привести к ложно-положительным результатам исследования, особенно при несоблюдении жестких правил организации лаборатории и порядка выполнения процедур.

Использование в ПЦР флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов, которые гибридизуются с комплементарными участками амплифицируемой ДНК-мише­ни, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции в процессе реакции, позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала как во время амплификации (в режиме реального времени), так и по ее окончании. Этот способ значительно снижает риск загрязнения лаборатории продуктами ПЦР и сокращает продолжительность анализа.

В условиях высокого охвата детей прививками против коклюша снижается эффективность бактериологического исследования и возрастает роль ПЦР как быстрого (в течение 4—6 ч) метода, позволяющего обнаружить ДНК возбудителя на более поздних сроках заболевания, чем бактериологический метод, и на фоне проведения антибиотикотерапии. При этом наличие в анамнезе вакцинации против коклюша не влияет на результаты ПЦР.

Необходимо учитывать, что в ПЦР обнаруживается также ДНК погибших микробов, которая сохраняется в биологическом материале дольше, чем жизнеспособные микроорганизмы (от 1 недели до 1 месяца). В связи с этим ДНК может быть обнаружена на фоне клинического выздоровления и после успешного лечения антибиотиками, поэтому ПЦР не рекомендуется использовать для подтверждения эффективности лечения, как это принято при бактериологическом исследовании или при использовании метода NASBA, в котором обнаруживается РНК бактерий (менее стабильного компонента генома, чем ДНК).

Максимальный уровень специфичности и чувствительности исследования обеспечивают тесты на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации.

Оптимальные сроки применения ПЦР в диагностических целях – с первых дней катарального периода заболевания и до трех недель болезни на момент обследования.

7.1. Взятие материала

Крайне важно проводить сбор материала для ПЦР до назначения специфической противомикробной терапии. Несоблюдение данного условия может привести к ложноотрицательному результату анализа.

Все работы по взятию, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 1.2.036—95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности».

Материалом для исследования методом ПЦР служат мазки со слизистой носоглотки и задней стенки ротоглотки. Рекомендуется исследовать оба типа мазков от каждого пациента. С этой целью целесообразно объединять и исследовать как одну пробу оба мазка, собранных последовательно разными зондами в одну пробирку. При этом сначала берут мазок со слизистой носоглотки, затем мазки с задней стенки ротоглотки, помещая рабочую часть зонда с тампоном в ту же пробирку, в которую был ранее помещен конец зонда с тампоном, содержащим собранный материал со слизистой носоглотки. Если полость носа заполнена слизью, перед процедурой рекомендуется провести высмаркивание. За 2 ч до взятия мазков из ротоглотки нельзя пить и принимать пищу. В течение 6 ч перед процедурой нельзя использовать медикаменты, орошающие носоглотку или ротоглотку и препараты для рассасывания во рту.

Мазки со слизистой носоглотки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2—3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину до носоглотки, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (3—4 см для детей и 5—6 см для взрослых). После взятия материала конец зонда с тампоном опускают в стерильную одноразовую пробирку с 0,5 мл транспортной среды до места слома, при этом гибкая часть зонда сворачивается спиралью, далее, прикрывая сверху пробирку крышкой, рукоятку зонда опускают вниз, добиваясь полного отламывания верхней части зонда. Пробирку герметично закрывают.

Мазки из ротоглотки берут сухими стерильными зондами из полистирола с вискозными тампонами вращательными движениями с задней стенки ротоглотки, аккуратно прижимая язык пациента шпателем, не касаясь щек, миндалин и языка. После взятия материала рабочую часть зонда с тампоном помещают на глубину 1,5 см в стерильную одноразовую пробирку с 0,5 мл транспортной среды. Рукоятку зонда с тампоном опускают вниз и отламывают, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Пробирку герметично закрывают и маркируют.

7.2. Доставка и хранение материала

Допускается хранение материала в течение трех суток при температуре 2—8 °С, более длительно – при температуре не выше минус 16 °С.

Каждая пробирка с биологическим материалом должна быть проверена на герметичность и промаркирована в соответствии с прилагаемым списком. Направление оформляется согласно п. 5.3. Пробирку с биологическим материалом от каждого пациента помещают в индивидуальный полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве, достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки, пакет герметично закрывают. При необходимости транспортирования материала от нескольких пациентов индивидуальные пакеты помещают в пакет большего объема. Полиэтиленовые пакеты помещают в термоизолирующий контейнер (термос, сумка-холодильник), приспособленный для транспортирования биологических материалов, и транспортируют при температуре 4—8 °С.

7.3. Проведение исследования

Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН 2.1.7.2790—10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» и методических указаний МУ 1.3.2569—09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности».

Подготовка биологического материала к ПЦР-исследованию

Непосредственно перед исследованием содержимое закрытой пробирки с мазками из носоглотки / ротоглотки перемешать на вортексе и центрифугировать в течение 5 с при 5 тыс. g на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки. Открыть пробирку и, не извлекая зондов, отобрать необходимое количество образца для исследования.

Порядок проведения ПЦР-исследования

Исследование проводится с использованием наборов реагентов, разрешенных для применения в установленном порядке. Оборудование и материалы, необходимые для проведения ПЦР-исследования, указаны в МУ 1.3.2569—09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности» и в инструкциях к используемым наборам реагентов для обнаружения ДНК возбудителей коклюша, паракоклюша и бронхисептикоза методом ПЦР.

Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в двух отдельных помещениях (зонах: зона экстракции нуклеиновых кислот и зона амплификации нуклеиновых кислот) при проведении ПЦР с детекцией в режиме реального времени и в трех отдельных помещениях (зонах: зона экстракции нуклеиновых кислот, зона амплификации нуклеиновых кислот и зона детекции нуклеиновых кислот) при проведении ПЦР с детекцией методом электрофореза. Работу следует начинать в зоне экстракции нуклеиновых кислот, продолжать в зонах амплификации и детекции. Нельзя возвращать образцы, оборудование и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое. Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также использованные реактивы (включая буфер и гели) следует удалять в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790—10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами». При работе методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов. Жесткие требования должны быть предъявлены к организации работы в зоне электрофореза: запрещается перемещение персонала из помещения для электрофореза в другие рабочие помещения лаборатории. Смена рабочей верхней одежды, головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при выходе из помещения для электрофореза.

Порядок проведения ПЦР-исследования и интерпретация результатов анализа должны выполняться строго согласно инструкции изготовителя набора реагентов. С целью обеспечения качества процедуры исследования каждого образца целесообразно использовать внутренний контрольный образец, который добавляется в биологический образец на этапе экстракции ДНК. Обязательно использование отрицательных контрольных образцов этапов экстракции ДНК и постановки ПЦР, а также положительного контрольного образца этапа ПЦР.

С целью обеспечения контроля качества ПЦР-анализа периодически рекомендуется проводить контроль контаминации лаборатории фрагментами амплификации ДНК согласно методике, представленной в прилож. 9.

7.4. Материалы и оборудование

Материалы, необходимые для взятия образцов
для исследования методом ПЦР

1) Транспортная среда для хранения и транспортирования респираторных мазков или: стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида (ГОСТ 4233) в 0,01 М калий-фосфатном буфере, pH 7,0 (смесь KH₂PO₄ (ГОСТ 2493) и K₂HPO₄ (ГОСТ 4198)), в аликвотах по 0,5 мл в стерильных пробирках объемом 1,5 мл, раскапанный в стерильных условиях.

2) Педиатрический назофарингеальный велюр-тампон на пластиковом аппликаторе – зонд для взятия мазков со слизистой носоглотки у детей.

3) Гибкий назофарингеальный велюр-тампон на пластиковом аппликаторе – зонд для взятия мазков со слизистой носоглотки у взрослых.

4) Зонд-тампон (полистирол с тампоном из вискозы), в индивидуальной упаковке, стерильный – зонд для взятия мазков из ротоглотки у детей и взрослых, допустимо его использование для взятия мазков со слизистой носоглотки у взрослых.

⇐ Предыдущая123456Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: