Питательный агар с тирозином

К 100 мл дистиллированной воды добавляют 3,5 г сухого питательного агара и 0,1 г тирозина, расплавляют над пламенем горелки, разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атм. 20—30 мин.

Бульон Хоттингера с мочевиной

К 100 мл бульона Хоттингера pH = 7,0 добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6 %-го спиртового раствора крезолового красного, стерилизуют текучим паром при 100 °С в течение 15 мин. Посев производят в 1 мл среды петлей, выдерживают 24 ч при 35—37 °C.

Приготовление реактивов для определения уреазы (по методу Заксе)

Готовят 2 реактива. Реактив А: 2 г мочевины, 2 мл 96°-го этилового спирта, 4 мл дистиллированной воды. Реактив Б: 1 мл 0,2 %-го спиртового раствора фенол-рота, 0,1 г KH₂PO₄, 0,1 г K₂HPO₄, 100 мл дистиллированной воды, 0,5 г хлористого натра. Реактив А не стерилизуют и хранят при температуре 4—10 °С, реактив Б стерилизуют в автоклаве текучим паром. Перед употреблением смешивают 1 часть реактива А и 19 частей реактива Б.

Приложение 7

Хранение культур бордетелл

Работа с культурами для контроля качества среды

Коклюшная культура, высушенная из замороженного состояния под вакуумом, может храниться неопределенно долгое время при сохранении вакуума в ампуле и при температуре не выше 10 °С. Ампулу с высушенным штаммом вскрывают стерильно над лотком. Верхний конец ампулы нагревают на пламени горелки и снимают парафин, затем кусочком стерильной ваты, смоченным в стерильной воде, осторожно прикасаются к оттянутому концу ампулы так, чтобы получилась небольшая трещина, и той же мокрой ватой обводят вокруг носика ампулы. После образования круговой (или неполностью круговой) трещины легким ударом пинцета удаляют конец ампулы. После вскрытия ампулы в нее стерильно наливают 0,2—0,3 мл стерильного физиологического раствора. После растворения сухого содержимого ампулы его переносят пастеровской пипеткой на чашку с питательной средой и 48—72 ч выращивают при температуре 35—37 °C.

В первых пересевах микробы обладают несколько пониженной жизнеспособностью. Для восстановления полной жизнеспособности требуется 2—3 пассажа на оптимальных питательных средах. Рекомендуется для работы пользоваться культурой после второго или третьего пересева. В дальнейшем коклюшные культуры сохраняют на среде Борде-Жангу или КУА с 10 % крови, пересевая 1 раз в 3—4 недели. Можно пользоваться культурой не более 10 пассажа.

Способы длительного хранения (без пересева)

1. Хранение культур коклюшного микроба в консервирующей смеси (рецепт МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского)

Готовят 2 раствора: 1 – 80 %-й раствор глицерина в буферном физиологическом растворе; 2 – сахарозо-желатиновая среда (10 %-й раствор сахарозы и 1 %-й раствор желатина). Смешивают по 2 мл первого и второго растворов в стерильных агглютинационных пробирках, помещают на дно пробирки 3—4 петли 3-суточной культуры коклюшного микроба и хранят в морозильной камере холодильника или в глубоко морозильной камере при –30 °C под ватно-марлевой пробкой до 1 года. При высевах берут петлей часть материала со дна пробирки и высевают на среду КУА с 3—4 % крови, растирая шпателем.

Приготовление 80 %-го раствора глицерина в буферном физиологическом растворе:

1) приготовление буферного физиологического раствора pH 7,2 (на 8 л):

NaCl – 69 г 200 мг, Na₂HPO₄ – 15 г 360 мг, KH₂PO₄ – 3 г 520 мг растворяют в 8 л дистиллированной воды, автоклавируют при 0,3 атм. в течение 30 мин;

2) 80 %-й раствор глицерина стерилизуют в автоклаве при 1,8 атм. в течение 30 мин.

Приготовление сахарозо-желатиновой среды:

На водяной бане при 55 °C растворить в 300 мл дистиллированной воды 10 г желатина; растворить в 300 мл дистиллированной воды 100 г сахарозы; соединить 1 и 2 растворы, довести дистиллированной водой до 1 л, установить pH 7,0 раствором бикарбоната натрия, стерилизовать текучим паром в автоклаве три дня по 1 ч. Хранить разлитым во фла­коны.

2. Хранение культур коклюшного микроба в полужидком КУА (с кровью и без крови), метод предложен ЦГиЭ г. Москвы

Казеиново-угольный агар готовится по прописи, но агар-агара добавляют 1 г на 1 л среды (0,1 %), разливают по пробиркам (в количестве до 8 мл) и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин. В полужидкий агар КУА можно добавить стерильную дефибринированную кровь крупного рогатого скота, лошади из расчета 0,5—1 мл на 8 мл среды. Культуру коклюшного микроба засевают в среду, выдерживают в термостате 3—4 дня, а затем без пересева сохраняют в холодильнике или при комнатной температуре в течение 1 мес. При хранении культуры коклюшного микроба на плотной среде КУА ее пересевают через 10—14 дней.

Приложение 8

Журнал по бактериологической диагностике коклюша

№ п/п	Фамилия, имя	№ поликлиники, направляющей исследуемый материал	Адрес ребенка	Детское учреждение, посещаемое ребенком	Кратность обследования (1—2 раза)	Характер тампона	Просмотр чашек (кол-во снятых колоний)
							72 ч	96 ч	120 ч
						Сухой
						Влажный

Продолжение

Образование пигмента при посеве чистой культуры	Мик­ро­скопия	Ориентировочная реакция агглютинации				Фермен-тация мочевины (проба Заксе)	Наличие роста на МПА	Образо­вание пигмен­та на агаре с тирозином	Бордетелла бронхисептика
		физиол. раствор	неадсорб. специфич. сыворотки 1: 10	фактор- ные сы- воротки					подвиж- ность	фермен- тация цитрата натрия на среде Симмонса
				1	14

Продолжение

Определение серовара коклюшного микроба (агглютинация с сыворотками к факторам)		Результаты исследования
2	3

Приложение 9

Методика проведения смывов с целью контроля
контаминации лаборатории продуктами ПЦР

Назначение

Процедуру рекомендуется проводить в случае получения положительных сигналов при амплификации отрицательных контролей этапов экстракции и ПЦР или планово с необходимой периодичностью в зависимости от интенсивности работы (например, 1 раз в неделю – при ежедневном проведении исследований, но не реже, чем 1 раз в месяц). Взятие смывов проводят в первой половине рабочего дня.

Материалы:

· среда для взятия смывов – ТЕ-буфер (или деионизованная вода),

· палочки с ватными наконечниками (зонды с ватным тампоном),

· наборы реагентов для ПЦР, с которыми работает лаборатория.

Контрольные точки для смывов:

· рабочие и контактные поверхности лабораторного оборудования (автоматические пипетки, центрифуги, микроцентрифуги/встряхивате­ли, амплификаторы, термостаты, холодильники);

· поверхности лабораторных материалов (штативы, пакеты с реакти­вами, упаковки расходных материалов, ножницы, пинцеты, маркеры и др.);

· рабочие и контактные поверхности лабораторных столов, боксов, ламинарных шкафов;

· прочие контактные поверхности (ручки дверей, кнопки компьютеров, компьютерные мыши, телефоны, компьютерные столы, прочая лабораторная мебель).

Процедура взятия смывов

1) Надеть перчатки, протереть их салфеткой, смоченной 70 % этиловым спиртом.

2) Отобрать необходимое количество стерильных пробирок, в стерильных условиях в каждую пробирку внести 300 мкл ТЕ-буфера (или деионизованной воды).

3) Промаркировать пробирки в соответствии с названиями контрольных точек.

4) Для взятия смыва с каждой контрольной точки выполнить следующее:

· открыть пробирку, смочить зонд с ватным тампоном в ТЕ-буфере (или деионизованной воде), после чего пробирку закрыть;

 

· вращательными движениями провести зондом по поверхности объекта (из списка контрольных точек);

· тщательно прополоскать рабочую часть зонда в ТЕ-буфере (или деионизованной воде), отжимая его о стенки пробирки и избегая разбрызгивания раствора;

· удалить зонд в контейнер для отходов.

5) Для взятия смывов с каждой новой контрольной точки использовать отдельный зонд.

6) При взятии смывов с ламинарного шкафа: первоначально открыть переднее стекло, взять смывы с пипеток, оборудования, штативов для наконечников и пробирок, с рабочих поверхностей, затем с ручек и кнопок. Далее закрыть переднее стекло и включить ультрафиолетовое облучение.

7) Пробирки со смывами перенести в зону постановки ПЦР.

Постановка ПЦР

ПЦР-исследование полученных смывов с контрольных точек проводится в обычном порядке по инструкции к набору реагентов, начиная с этапа амплификации ДНК.

Интерпретация результатов

· Результаты анализа смывов считаются достоверными только в случае получения корректных результатов для положительных и отрицательных контролей амплификации в соответствии с инструкцией к набору реагентов.

Контрольные точки, в которых выявлены положительные результаты ПЦР, необходимо подвергнуть обработке веществами, деградирующими ДНК (препараты, содержащие активный хлор, см. МУ 1.3.2569—09), и облучению в ультрафиолетовом спектре.

 

⇐ Предыдущая123456

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: