 |
Определение токсичности почв и воды методом высечек листьев (по разрушению хлорофилла).
|
|
|
|
Содержание хлорофилла в листе – весьма изменчивая величина и с его разрушением связана хлоротичность (исчезновение темно-зеленого цвета и появление желтизны). На круглой высечке листа (в большинстве случаев по краям) по мере длительности опыта нарастают хлоротичные и некротические участки. Это явление можно проследить визуально и довольно быстро определить токсичность того или иного компонента или их суммы в тех или иных сочетаниях, встречающихся в природе. Инкубация высечек производится на 2%-ной сахарозе (питательная среда для большинства биотестовых испытаний) с добавлением токсикантов. Контроль – 2%-ная сахароза.
По прошествии определенного времени, которое для разных видов растений и типов листьев различно и требует предварительной апробации, хлорофилл в высечках может быть определен визуально по сравнению с контролем, который принимается за 100 процентов. А также инструментально (фотоколоримерически).
Оборудование, реактивы, материалы
1) эксикаторы; 2) фильтры или фильтровальная бумага; 3) чашки Петри; 4) побочное сверло или гильзы диаметром 10мм; 5) пинцеты; 6) пипетки; 7) колбочки на 100мл; 8) воронки; 9) пузырьки из-под пенициллина или пробирки в штативе; 10) карандаш по стеклу; 11) 2%-ный раствор сахарозы; 12) загрязненная вода водоема; 13) почва, примыкающая к автодороге; 14) листья растений, находящихся в стадии вегетации. Все оборудование и материалы стерилизуются.
Ход работы.
А. Испытание вытяжки из почвы
Взятые образцы почв (например, одинаковые типы почв под уличными посадками в разных частях города, различающиеся по загруженности улиц транспортом) растирают в ступке и просеивают через мелкое сито. Взвешивают на кальке 10 г почвы в трехкратной повторности, пересыпают в колбочку или стаканчик, приливают 25 мл дистиллированной воды. Энергично взбалтывают 10-15 мин на качалке или вручную, оставляют на ночь. Затем жидкость фильтруют через воронку со складчатым фильтром. Жидкость с колбой стерилизуют в кипящей водяной бане методом погружения и кипячения 10-15 мин. Горлышко колбы закрывают фольгой. Охлаждают, затем этой вытяжкой смачивают 2 фильтра до полной влагоемкости. Фильтры стерилизуют вместе с чашками Петри. На фильтры раскладывают диски листьев наземных растений нижней стороной вниз. Повторность трехкратная (по 10 дисков).
|
|
|
Чашки Петри закрывают крышками и ставят в термостат в темноту при температуре +25о – (+26)о С. Наблюдения проводят через 1 сутки утром и вечером каждого дня.
Контролем служат диски, помещенные на чистую простерилизованную воду. Результаты выражают в процентах от контроля, взятого за 100. Или абсолютно (по площади пораженной ткани). График строят по аналогии, как в опыте с газом.
В. Испытание токсичности загрязненной воды
Взятая для испытаний вода упаривается на водяной бане в 10 раз, ею смачивают 2 фильтра до полной влагоемкости, на которые укладывают диски, высеченные из листьев растений. Чашки Петри с дисками устанавливают в термостат, инкубацию и оценку производят так же, как и в предыдущем опыте. Количество хлорофилла в высечках можно также определить фотометрически.
Следует отметить, что работа с питательной средой, содержащей сахарозу и элементы минерального питания (из почвы и воды) без стерильных условий, чревата искажением результатов из-за бактериального загрязнения. В связи с этим питательную среду лучше простерилизовать в автоклаве.
ЗАДАНИЕ 2.
Биотестирование летучих токсических веществ, воды и вытяжки из почвы по прорастанию семян.
Тест на прорастание семян хорошо разработан и очень давно применяется для установления воздействия различных физиологически активных веществ. Биологические пробы применимы и для токсикологической оценки различных компонентов окружающей среду (в том числе и воздушного загрязнения).
|
|
|
Приготовление вытяжек почв, концентрирование воды описаны в предыдущей работе. Данную работу можно расширить за счет использования других токсикантов (например, солей тяжелых металлов), которые в малых концентрациях усиливают ростовые процессы, а в больших – подавляют. К подобным веществам можно отнести и микроэлементы, которые в растениях и у животных входят в состав ферментных систем, а при больших концентрациях проявляют себя как токсиканты.
Обычно используют мелкие семена (льна, кресс – салата, мака, рыжика, укропа и др.). Для достоверной оценки применяют не менее трех тестов с разными видами семян. Лучше использовать свежесобранные семена, так как на лежалых семенах развивается сапрофитная микрофлора и при прорастании в условиях влажных камер (колбы, чашки Петри, пробирки) они могут загнивать и выбывают из опыта.
С целью профилактики семена протравливают. Для этого сухие семена погружают в 1% - ный раствор марганцовокислого калия на 0,5 часа, а затем промывают дистилированной водой, используя два слоя марли, обсушивают на фильтровальной бумаге на воздухе.
Оборудование, реактивы, материалы.
1) Широкогорлые колбы с пробками; 2) чашки Петри; 3) проволочки; 4) вата; 5) пинцеты; 6) большие пробирки; 7) пенициллиновые пузырьки; 8)пипетки; 9) фильтры; 10) карандаш по стеклу; 11) семена тест – растений: кресс – салата, редиса, льна и др.; 12) токсические летучие вещества: бензол, ксилол, ацетон; 13) водная вытяжка из почвы (смотри задание 1); 14) загрязненная вода.
Ход работы
1. На дно широкогорлой колбы помещают вату или фильтровальную бумагу, выделяющиеся токсические пары тех или иных веществ, которыми они пропитаны. К пробирке на проволоке подвешивают шарообразный комок обильно увлажненной ваты, в которой предварительно вдавливают семена тест – растения. Другую колбу без токсичных паров, но с ватой и семенами, используют как контроль. Ставят обе колбы в термостат при температуре 25 – 260 С до начала прорастания, а затем выставляют на свет.
|
|
|
Наблюдают за появлением всходов и ростом проростков (число всходов, развертывание листочков), а затем измеряют длину и массу каждого проростка.
2. В большие пробирки на дно помещают источники газообразных токсических выделений (смоченные ватки). Пробирки располагают наклонно, вблизи горлышка каждой кладут сложенный втрое фильтр, увлажняют 1 – 2 мл воды и засевают мелкими семенами мака, салата, рыжика и пр., пробирки закрывают пробками. Через несколько дней производят оценку прорастания семян и роста проростков путем измерения последних.
3. Два фильтра, смоченные 2 мл вытяжки из почвы, или загрязненной водой (в случае очень слабого загрязнения нужна концентрация воды) помещают на дно чашки Петри, раскладывают на них 50 семян, закрывают крышкой, ставят в термостат при температуре + 250 - (+26)0 С. Через некоторое время оценивают степень прорастания семян и величину проростков по отношению к контролю, принятому за 100 %. Контроль ставят на дистиллированной воде. В научных целях (например, для дипломной работы) оценку производят тогда, когда семена в контрольном варианте прорастут на 50 %.
Затем строят диаграммы ингибирования роста семян по отдельным показателям и компонентам: процент прорастания, размер всего проростка, развертывание семядолей и др.
Вопросы для контроля:
1. Почему индикационный метод в современных условиях считается перспективным методом исследования?
2. Назовите прямые и косвенные виды – индикаторы. Почему прямыми индикаторами служат стенобионтные виды организмов?
3. Как делятся индикаторы по степени географической устойчивости?
Литература:
1. Соколов М.С., Монастырский О.А., Пикушова Э.А. Экологизация защиты растений. - Пущино. – 1994. – С. 145.
2. Хржановский В.Г., Викторов С.В., Литвак П.В., Родионов Б.С. Ботаническая география с основами экологии растений. – ВО «Агропромиздат». – 1986. – С. 199-216.
3. Федорова А.И., Никольская Н.А. Практикум по экологии и охране окружающей среды. – М.: Гуманит. Изд. Центр ВЛАДОС, 2001. – С. 151 – 157.
|
|
|
