Индикация и идентификация вируса

Обнаружение специфических телец-включений. Вирус ИЛТ размножается в эпите­лиальных клетках слизистой оболочки гортани, трахеи, клоаки, вызывая острое воспаление этих оболочек с образованием внутриядерных включений. Включения обнаруживаются до наступления некроза эпителия между 1-м и 5-м дн после интратрахеального заражения цы­плят. В мазках из конъюнктивы включения находят через 48 ч после заражения. Ядро, со­держащее включение, обычно увеличено, отмечается гиперхроматия ядерной оболочки. Включения имеют округлую форму, иногда форму диплококков и занимают 1/2 -1/3 кле­точного ядра. Вокруг включения видна неокрашенная зона, что считается характерным. Бо­лезнь можно диагностировать на основании обнаружения внутри ядерных включений. Для этого на предметных стеклах готовят мазки из соскобов эпителия слизистой оболочки, фик­сируют в абсолютном метиловом спирте в течение 3-5 мин окрашивают раствором краски Гимза (1капля краски на 1 мл дистиллированной воды) в течение 2 ч при 37°С, затем мазки промывают, обрабатывают абсолютным метиловым спиртом, снова промывают, высуши­вают и просматривают. В положительных случаях цитоплазма эпителиальных клеток окра­шивается в бледно-голубой цвет, ядерные оболочки таких клеток более темные, внутриядер­ные включения четко видны, светло- красного цвета, по форме варьируют (шарообразные или колбасовидные), окружены ясно видимыми светлыми ободками. Количество их в ядре от 1 до 4. Указанный метод позволяет иногда в течение 3-4 ч диагностировать ИЛТ даже при атипичном проявлении. Вероятность обнаружения телец-включений в патологическом материале существует только в начальной фазе болезни - между 2-7 дн.

ИФ. Позволяет обнаружить вирусный АГ при помощи специфической флюоресцирую­щей сыворотки в мазках из слизистой оболочки трахеи, конъюнктивы от больных цыплят (в период острого течения болезни), из пораженной ХАО и инфицированных культур клеток. Реакцию ставят по общепринятой методике. Чаще используют прямой метод. Положитель­ную ИФ в мазках от больной птицы наблюдают в период острого течения болезни, когда обнаруживаются внутриядерные включения и можно выделить вирус на КЭ.

Биопроба. Ставят ее на цыплятах 30-90- дн возраста путем аппликации вируссодержащего материала на слизистую оболочку гортани, трахеи, глаз, носа, подглазничного синуса, клоаки. При наличии вируса в исследуемом материале у зараженных цыплят на 6-12 дн раз­виваются типичные клинические признаки экспериментальной инфекции. При инокуляции материала в подглазничный синус в положительных случаях развивается синусит с отеком, выделениями из носовых ходов и слезотечением. Положительная реакция на клоачную про­бу проявляется с 3-го по 8-й дн, но чаще на 4-5 дн в виде отечности слизистой оболочки -фабрициевой сумки и катарального, геморрагического или фибринозного воспаления.

Наблюдение за зараженными цыплятами ведут до 14 дн. Чаще всего заражение проводят на слизистую оболочку трахеи и клоаки, так как этот метод позволяет определить виру­лентность штамма, а также провести дифференциацию от вирусов, вызывающих сходное поражение ХАО у инфицированных КЭ. При интратрахеальном заражении 4-нед цыплят вирулентным штаммом CS-1 вируса ИЛТ. Наибольший титр вируса в тканях трахеи (10⁶ БОЕ/г) установлен на 2-4-е сут. Позднее количество вируса резко снижалось и на 7 дн его не обнаруживали, хотя антиген вируса в эпителии трахеи и в большом количестве выявляли еще на 7-8 сут с помощью ИФ.

Последнее время естественные инфекции все чаще протекают нетипично, абортивно, хронически или даже бессимптомно. Выделяемые штаммы также менее патогенны для КЭ, не всегда приводят к их гибели и даже не всегда вызывают патологические изменения на слизистых оболочках при непосредственном введении исследуемого материала.

РН. Реакцию ставят по общепринятой методике. Чаще всего в диагностической практи­ке используют метод: - разведение вируса и постоянная доза сыворотки. Результаты РН вы­ражают в индексах нейтрализации. Принято индексы нейтрализации от 1 до 9 считать отри­цательными, от 10 до 49 - сомнительными, от 50 и выше - положительными. РН можно про­водить и в культуре клеток ПЭК и 3-8 дн цыплятах.

РДП. Для идентификации возбудителя в РДП используют набор куриных антисыворо­ток, полученных к различным вирусам птиц. РДП ставят по общепринятой методике. Для РДП при диагностике ИЛТ птиц 1,5%-ный агаровый гель готовят на верональном буферном растворе с рН 7,2 следующим образом: в 100 мл горячей дистиллированной воды растворя­ют 1,84 г веронала, после охлаждения доливают дистиллированной водой до 1000 мл и рас­творяют в полученном растворе 10,3 г мединала. Раствор хранят при 4°С. Реакция проста по технике выполнения и позволяет выявлять примерно 75% положительных случаев, установ­ленных при помощи заражения эмбрионов. РДП специфична, но недостаточно чувствитель­на, ее используют главным образом для ретроспективной диагностики среди взрослых кур.

Приготовление гипериммунных сывороток и антигенов. Гипериммунные вирус-нейтрализующие сыворотки получают на кроликах по следующей схеме. Вирус (суспензии ХАО 1:10 после центрифугирования при 2500 мин¹ в течение 30 мин) вводят кроликам внутривенно в течение 3 нед по 3 раза в неделю (через 1 дн): в первую нед - по 2 мл, во вто­рую - по 3, в третью - по 4 мл. Через 7 нед после первичной иммунизации кролику внутрибрюшинно инъецируют 10 мл вируса, а на следующий день - 15 мл внутривенно. Через 7 дн после последнего введения АГ кроликов обескровливают. Гипериммунные кроличьи сыво­ротки используют в РН для типирования вируса ИЛТ.

Получение гипериммунных преципитирующих сывороток на птице Центрифугированную суспензию вируссодержащей ХАО в разведении 110 вводят взрослым петухам в подкрыльцовую вену в объеме 1-2 мл по схеме 4 инъекции с промежутками в 1 день, 7 дн отдыха, 4 инъекции с промежутками в 1 день. На 6-й дн после последней инъекции пробно берут кровь из сердца, в случае не активности сыворотки проводят трехкратное введение вируса с суточными интервалами, на 6-ой день вторично берут пробу крови. Установлено что препараты очищенного вируса ИЛТ, полученные в градиенте плотности глицерин-тартрата, более пригодны для выделения вирионной ДНК, тогда как препараты, очищенные в перколе, лучше использовать в качестве специфического АГ для ИФА и получения специ­фических сывороток. По данным ЭМ препараты вируса ИЛТ, очищенные в перколе, практически не содержат примесей клеточных компонентов (везикул).

Идентификация вируса с помощью монАТ. По чувствительности ИФА с монАТ со­поставим с методом выделения вируса, но более быстрым и более чувствительным по срав­нению с ИФ В ИФА используют кроличьи поликлональные AT и мышиные монАТ.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. В нетипичных случаях, особенно при хроническом течении инфекции, провести диагностику позволяет установление роста титра антител при исследовании парных сывороток. Однако такого рода исследования про­водятся главным образом с целью получения данных, свидетельствующих о перенесении заболевания данной популяцией и указывающих на степень распространенности возбудите­ля на определенной территории. Пробы сыворотки от птицы исследуют дважды - через 14-28 дн интервал. Повышение титра антител к вирусу и числа положительно реагирующих птиц в стаде свидетельствует о наличии и распространении инфекции в хозяйстве, а сохра­нение или снижение уровня AT - о прошедшей инфекции. Для серологического исследова­ния кровь берут на 14-28-й дн от начала болезни не менее чем от 5-10 птиц по 5 мл от каж­дой. До начала исследования сыворотку сохраняют в замороженном состоянии при минус 20-70°С. Сыворотки больных и переболевших птиц, а также контрольные инактивируют при 56°С 30 мин.

Приготовление антигенов для РН и РДП. ХАО КЭ с характерными для данного ви­руса поражениями гомогенизируют с равным количеством буферного изотонического рас­твора с рН 7,2-7,4, к которому добавлены антибиотики из расчета по 100 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл раствора. Суспензию центрифугируют при 3000 мин¹ 20 мин. Надо садочную жидкость сливают и используют в качестве антигена, если она содержит вируса не менее 10⁵ ЭИДзо/мл АГ сохраняют в замороженном состоянии. Предложена следующая ме­тодика концентрации и очистки вируса вируссодержащий материал концентрируют полиэтиленгликолем с молм 6000, конечная концентрация его в вируссодержащей суспензии должна быть равна 7% Концентрирование ведут при 4°С в течение 3 ч, центрифугируют концентрированный вирус при 3000об/мин. 30 мин. Инфекционная активность полученного вируса - 1 О⁶-107 ЭИД ₅₀/мл

РН. Наиболее чувствительна по сравнению с РДП и РРИД. Она выявляет специфические AT у 96-98% инфицированных птиц независимо от формы течения заболевания. Одна ко эта реакция трудоемка и требует значительного количества КЭ. На КЭ или культурах клеток реакцию ставят по общепринятой методике, чаще используют модификацию посто­янная доза сыворотки и различные разведения вируса. Число рядов соответствует числу испытуемых сывороток плюс 2 ряда контроля (с нормальной и иммунной сыворотками), а число пробирок в ряду - числу разведении вируса. После контакта (1ч при комнатной тем­пературе) смесь сыворотки с каждым разведением вируса инокулируют не менее чем 4 КЭ на ХАО по 0,2 мл. Эмбрионы инкубируют при 37°С в течение 6 дн. При вскрытии выявляют специфические изменения на ХАО. В РН рекомендуется использовать неразведенные сыворотки. Оценку результатов проводят по индексу нейтрализации. Сыворотку с ИН 10 или меньше, считают отрицательной, а с индексом больше 10 – положительной.

РДП. Проводят по общепринятой методике, используя стандартный АГ Эта реакция может выявить 25-50% переболевших птиц. Однако простая техника постановки ее и бы­строе получение результатов дают возможность с минимальными затратами средств и вре­мени обследовать большое количество птицы. Специфический антиген готовят из вакцинно­го вируса ИЛТ клона НТ. Вируссодержашую суспензию - центрифугат гомогенизированных ХАО - концентрируют, используя 1%-ный раствор полиэтиленгликоля на дистиллированной воде, либо полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000) при добавлении в суспензию из расчета 7%.

Антисыворотку к вирусу ИЛТ получают гипериммунизацией морских свинок и птиц. В первом случае используют концентрированный вирус ИЛТ с титром не ниже 10⁸ЭИД5о/мл^-, которым иммунизируют морских свинок по следующей схеме: первая иммунизация в объе­ме 0,1 мл внутрикожно в плантарную поверхность обеих лапок, вторая иммунизация - через 7-9 дн в объеме 1 мл подкожно в область верхней губы; последующие 2 инъекции - через 14-16 и 21-23 дн после второй проводят аналогично. Через 10 дн после последнего введения АГ морских свинок тотально обескровливают. Уровень AT в РДП составлял, как правило, 1 16 и выше, в лиофилизированном состоянии сыворотки сохраняли свою активность 2 г.

Птиц (молодок и петухов в возрасте 90-120 дн) гипериммунизируют по схеме: первый и второй раз (через 2 дн) иммунизируют специфическим АГ внутривенно в объеме 1 мл, тре­тий раз через 16 дн и четвертый раз через 30 дн -проводят интратрахеально в таком же объ­еме. Через 15 дн после последней иммунизации берут пробу крови и исследуют на актив­ность и специфичность. Если активность сыворотки в РДП со специфическим АГ 1:32 и выше, то у такой птицы тотально (из сердца) берут кровь, сыворотку от которой лиофилизируют и используют для выявления AT в органах и тканях больных и погибших птиц. Если титр специфических ПА в пробе сыворотки окажется ниже чем 1:32, то птицу им­мунизируют еще раз вирулентным вирусом ИЛТ в разведении 1:100 интратрахеально в объ­еме 0,5 мл. Через 10-12 дн птиц обескровливают и сыворотку лиофилизируют.

В качестве растворителя для приготовления геля используют 0,1М забуференный физ-раствор NaCl pH 7,2-7,4; забуференный фосфатный раствор состоит из 9 частей ОД5М рас­твора NaCl и 1 ной части 0,15М фосфатного буфера с рН 7,2 по Сервису, веронал-ацетатный буфер с рН 8,6 с ионной силой 0,1 и боратный буфер рН 8,4-8,6. Гель на этих буферных рас­творах готовят из расчета: 1,5 г агара на 100 мл растворителя. Растворяют агар в течение 1,5-2 ч в кипящей водяной бане, добавляя в расплавленный агар консервант (риванол, азид натрия и др.). Горячий агар разливают по 3 мл на предметные стенки или по 35 мл в чашки Петри, расположенные строго горизонтально. Как только агар затвердеет, пластинки можно использовать в РДП. Таким образом, для диагностики ИЛТ рекомендуется РДП на ага­ровом геле, приготовленном на боратном, либо фосфатном буферных растворах. РДП при­годно для выявления специфических AT в крови больных и переболевших птиц, а также ви­русного АГ ИЛТ в органах погибших птиц. Разработаны условия получения специфического вируса ИЛТ, активность его РДП 1:4-1:32, а в твердофазном ИФА 1:265-1:4000.

ELISA. Оказался более чувствительным, чем РН, по чувствительности приближается к ИФ У отдельных экспериментально зараженных цыплят с помощью ELISA и РИФ удава­лось выявить AT в более ранние сроки, чем в РН. Разработан твердофазный ИФА для выяв­ления специфических AT к вирусу ИЛТ в сыворотках крови вакцинированных птиц. Мето­дом шахматного титрования была выработана сенсибилизирующая доза антигенов и разве­дения иммунопероксидазного конъюгата. В ИФА можно выявлять специфические антитела в титрах 1:100-1:200 в сыворотках крови вакцинированных птиц. Аналогичные титры в РН и РДП соответственно составляли 1:8-1:32 и 1:2-1:16 (12). ELISA и РН (микрометод) ус­пешно применяли для обнаружения AT в стадах с субклиническим течением ИЛТ. Обнару­жить поствакцинальные AT к вирусу болезни в сыворотках цыплят с помощью ELISA уда­ется через неделю после вакцинации. Также предложен усовершенствованный метод ELISA путем введения в реакцию авидин-биотин-ферментного комплекса. Он пригоден и для оцен­ки поствакцинального иммунитета.

Дифференциальная диагностика. При постановке диагноза на ИЛТ необходимо исключить НБ, оспу, ИБК, заразный насморк, хронический пастереллез, респираторный микоплазмоз и др.