Серодиагностика и ретроспективная диагностика

Основывается на обнаружении ВНА и ПА в сыворотках крови больных и переболевших птиц. Выделение вируса из пораженных органов удается не всегда, поэтому лучшим мето­дом диагностики ИБ является серодиагностика. Кроме того исследование сывороток прово­дят при бессимптомном течении болезни. Используют парные сыворотки крови, получен­ные от одних и тех же птиц (или от одной и той же группы птиц). Важное значение в про­филактике ИБ имеет систематический контроль за иммунным состоянием стада. Такой кон­троль осуществляют посредством периодических исследований парных сывороток крови.

РН. В качестве АГ используют эталонный вирус ИБ. Исследуемые сыворотки и нор­мальную (контрольную) сыворотку перед постановкой реакции инактивируют при 58°С 30 мин. ВНА в сыворотке больных цыплят обнаруживаются, начиная с 13-го дня после заражения, их уровень зависит от возраста птицы, используемой для заражения. Так, у 4-нед цыплят уровень AT выше (ИН 3,5 lg), чем у 3-нед (1,5-2 lg). Способность вырабатывать AT после введения вируса у старших цыплят выражена сильнее, чем у молодых; AT сохраняют­ся в течение более 3 мес. ВНА обнаруживали через 3 дн в титре 1:8 у цыплят, зараженных вирусом. Титр AT достигал максимального значения (1:8000) через 7 дн.

РДП. ПА у птиц появлялись через 5 дн после экспериментального заражения и обнару­живались в течение 24 дн, по одним данным, и 70 дн, по другим, или всего периода яйце­кладки. Интенсивность РДП зависит от сроков исследования после заражения: реакция проявляется слабо до 10-го дня после заражения, становится заметной к 20-му дню и дер­жится более 20 нед. У цыплят, полученных от несушек, реагирующих интенсивно в РДП, ПА могут быть обнаружены до 5-6-дн возраста. Сыворотки с высокими титрами ВНА обыч­но бывают положительными и в РДП.

Установлена зависимость возраста птицы и титра AT; так, у 1-2-нед цыплят установле­ны титры AT 1:4 - 1:16, а у 3-нед - понижение до 1:2, у 4-6-нед - отсутствие AT, что соот­ветствовало морфологическим изменениям в исследуемых органах (фабрициева сумка, се­лезенка, зобная железа и миндалевидные железы слепой кишки). ПА у птиц образуются при естественном или искусственном заражении на 5-6-й день и сохраняются 2-3 мес, а ВНА чаще обнаруживают через 3 нед и сохраняются значительно дольше. Из этого следует, что отрицательный результат в РДП не говорит об отсутствии в сыворотке AT к вирусу ИБ. Раз­работан быстрый количественный метод РДП для оценки титра AT к вирусу ИБ с исполь­зованием 96-луночных панелей,а также метод обнаружения AT в РДП в течение 45 мин.

ELISA (ИФА). Для широкого серологического обследования применяют ИФА (ELI SA). Он позволяет раньше других тестов определять появление гуморальных AT. Предло­жен кинетический Kits-ELISA для определения уровня AT у птицы, иммунизированной про­тив ИБ. Kits-ELISA позволяет на микропланшетах одновременно анализировать 60 образ­цов. Блокирующий вариант ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью и в 100 и более раз выше чувствительности РДП при выявле­нии AT к вирусу ИБ. При исследовании сыворотки крови кур на наличие AT в ИФА и РДП получены сопоставимые результаты, что позволяет рекомендовать ИФА для практического использования в диагностике ИБ. Детально отрабо­тана методика постановки непрямого варианта ИФА.

Дифференциальная диагностика

ИБ необходимо дифференцировать от ИБК, НБ, БМ, лимфоидного лейкоза, саркомы Рауса, кокцидиоза, нефрозонефрита, аденовирусной апластической анемии, синдрома ожи­рения печени и почек, авитаминоза А, отравлений химическими иммунодепрессантами. При дифференциальной диагностике учитывают комплекс эпизоотологических, клинических, патологоанатомических, гистологических исследований и окончательно подтверждают виру­сологическими и серологическими результатами. Доказано бессимптомное течение ИБ цып­лят, которое удалось устанавливать с помощью гистологического и серологического иссле­дований в первую неделю после вылупления.

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Применение живых вакцин

Выявление AT без выделения инфекционного агента не может служить основанием для вынужденной вакцинации. Прежде всего необходимо идентифицировать серопринадлежность вируса, определить вирулентность и подтип. Серотип II, индуцирующий ПА, а также AT, выявляемые с помощью ТФ ИФА, не вызывает патологии. Кроме того, следует уточ­нить, какой уровень AT и процент их циркуляции в стаде являются показанием для вынуж- I денной вакцинации. По данным зарубежных исследователей, надежный уровень защиты J. обеспечивают титр ВНА не ниже 2,0 lg, ПА 1:8 и выше, AT, выявляемых ТФ ИФА,- не ни- t же 1:8000. В связи с этим следует определиться с диагностическим титром в зависимости от | серологической реакции, применяемой для детекции AT, и уровня сероконверсии при исследовании парных сывороток. При проведении мер специфической профилактики необходимо учитывать факторы, отрицательно влияющие на формирование стойкого иммунитета у птицы, включая АГ-различия вируса ИБ. Это прежде всего тип АГ, способ и частота (схема) его применения в процессе вакцинации, степень аттенуации или инактивации. Известно, что живой АГ инду­цирует как системный, так и локальный (в местах наиболее вероятного проникновения возбудителя), а инактивированный АГ- только системный (гуморальный) иммунитет. Отрица­тельно сказывается на иммунной системе высокая плотность посадки птицы, несбалансиро­ванное кормление, нарушение технологических приемов, санитарного режима и, особенно, инфицированность стада различными возбудителями, токсины и т.д. Полноценное питание обеспечивает высокую естественную резистентность, а витамины A, D₃, E и Zn действуют как адъюванты, способствующие выработке полноценного и напряженного иммунитета.

Схемы иммунизации против ИБ не могут быть одинаковыми для разных хозяйств, не­обходим глубокий и всесторонний анализ с выявлением соответствия (АГ-родства) приме­няемых вакцин с циркулирующим среди птиц эпизоотическим штаммам ИБ. По наблюдениям ряда исследователей, общие ветеринарно-санитарные мероприятия не обеспечивают полного оздоровления хозяйств от ИБ. Поэтому в комплексе мероприятий по профилактике и ликвидации инфекции основное внимание уделяется специфической профи­лактике - вакцинации, которая должна проводиться с учетом материнских AT. Так, установлена высокая степень корреляции (г) между содержанием AT в сыворотке крови несушек и желтках: для вируса ИБ - 0,84, вируса ИБК - 0,84, для реовируса - 0,91. Опреде- t ление AT в желтке яиц при мониторинге бройлерных промышленных стад с помощью ELISA вполне выполнимо и рекомендовано для широкого использования. Цыплята, имеющие материнские AT в 1-сут возрасте, обычно защищены от появления клинических признаков болезни на протяжении первых 30 да жизни. Дифференциация полевых изолятов, отнесенных к серотипу I, показала, что АГ-родство между ними со­ставило всего 35%. Эти изоляты вызывали частичную атрофию бурсы без клинического проявления болезни и гибели птиц, но снижали их мясную продуктивность. У вируса серотипа II АГ-родство с другими штаммами было еще меньше. Поэтому один из основных факторов эффективности специ­фической профилактики - соответствие циркулирующих эпизоотических штаммов и реко­мендуемых вакцин против ИБ.

Разработанные в 70-е гг. первые вакцины из аттенуированных полевых изолягов часто не давали положительного результата и могли вызывать клиническую форму ИБ. Усовер­шенствованные в последствии, так называемые "умеренные" вакцины не могли преодоле­вать пассивный иммунитет, а у интактных цыплят вызывали иммуносупрессию и клиниче­скую форму болезни. Полученные затем аттенуированные вакцины из клонированного шт. PGB-98 (Baxenedal) и шт. D-78 успешно использовались для профилактики ИБ, но и они не преодолевали высокий уровень трансовариальных AT и, следовательно, не создавали на­дежной защиты. Поэтому усилия ученых были направлены на создание живых вакцин, спо­собных преодолевать пассивный иммунитет и формировать напряженный активный имму­нитет Такие "горячие" вакцины (Bursin+, Bursin 2, 228Е и др) обладали повышенной реактогенностью для цыплят с низким уровнем трансовариальных AT, вызывали переболевание, активизировали условнопатогенную микрофлору, что вело к осложнениям и повышенной летальности. Во ВНИИЗЖ были созданы живые вакцины на базе отечественных шт. БГ и Winterfild, которые применяются в настоящее время для профилактики заболевания. Од­нако в ряде случаев при применении этих вакцин наблюдались осложнения у птиц.

Стратегия борьбы с ИБ должна базироваться на эффективных ветеринарно-санитарных мероприятиях, а затем на эффективной специфической профилактике. В мировой практике широко используются вирус-вакцины из клонированных и в различной степени ат­тенуированных штаммов, обладающих разной реактогенностью. Их применяют в зависимо­сти от эпизоотологического и иммунологического статусов птицепоголовья. Профилактику ИБ осуществляют массовой вакцинацией. Племенные стада вакцинируют инактивированной или лиофилизированной живой вакциной из умеренно иммуногенного штамма. В Анг­лии, например, цыплятам 2-3-нед возраста вводят "умеренную" вакцину, а по достижении возраста 16-20 нед - инактивированную эмульгированную машинную вакцину. В Испании цыплят в возрасте 3 нед и повторно в 40 дн возрасте прививают вакциной из шт. D-78, а в 100 дн - инактивированной вакциной. Голландские специалисты рекомендуют различные вирусвакцины и схемы с учетом уровня материнских AT: для бройлеров от вакцинирован­ных родителей- вакцину из шт. 228Е в возрасте 14-17 дн, а от непривитых кур - 8-12 дн; для цыплят яичных пород от вакцинированных родителей - первично в возрасте 3 нед и повтор­но - 4 нед; от непривитых кур первично в 2 нед и повторно - в 3 нед возрасте; кур родитель­ского стада прививают инактивированной вакциной в 16-20 нед возрасте. Рекомендуют применять вакцины из шт. БГ и Winterfild в зави­симости от иммунного статуса птицы. Первично прививают в 5- или 10-дн возрасте, по­вторно - в 15- или 20-дн возрасте и третий раз в 100-120-дн возрасте жидкой инактивиро­ванной вакциной. Большинство исследователей считают, что необходимо выяснить, какой титр пассивных AT не будет сказываться отрицательно на формировании поствакцинального иммунитета в зависимости от реактогенности применяемых вакцин и выработать единый критерий оценки. Отечественная сухая вакцина против ИБ из шт. БГ в условиях неблагополучного хозяйства превосходит по эффективности вакцину Гумбораль (Франция) и Гумбораль СПФ (Хорватия). Она создает напряженный иммунитет при 2- или 1-кратной вакцинации цыплят в возрасте 10 сут и старше. В практике широко применяется сухая культуральная вакцина против ИБ из шт. ВНИВИП. Препарат безвреден для молодняка птиц и обладает выраженными иммуногенными свойствами. Установлено, что уровень материнских AT, соответствующий среднему по данной группе цыплят титру в ИФА 1:400, гарантирует достаточную защищенность птицы от инфекции и не препятствует эффективной вакцинации. По данным других исследователей, ма­теринские AT недостаточны для защиты цыплят от инфекции патогенным штаммом даже если куры-несушки были раньше вакцинированы бустерными дозами инактивированной масляной вакцины. Материнские AT могут интерферировать с вакцинным шт. D-78, кото­рый способен индуцировать образование AT в высоком титре.

Применение инактивированных вакцин. Для приготовления инактивированных вак­цин вирус ИБ размножают в КЭ и культурах клеток. Концентрацию АГ вируса определяют методом двойного сэндвич-ELISА. Вирус инактивируют формалином или рпропиолактоном, добавляют ГОА. Препарат вводят подкожно или внутримышечно. При достаточ­ной концентрации АГ (не менее 6 lg БОЕ), инактивированная вакцина обладала выражен­ной иммуногенностью.

Сообщается о полевых испытаниях сравнительной иммунологической активности 2-х серий экспериментальной эмульсинвакины БелНИИЭВ против ИБ и коммерческой вакцины такого же типа фирмы Интервет. Исследования показали, что вакцина БелНИИЭВ способна индуцировать у привитых ремонтных птиц сывороточные AT в защитных титрах и оказа­лась предпочтительнее вакцины Интервет.

Генно-инженерные (молекулярные) вакцины. Самым важным по иммуногенным свойствам оказался белок 35000 Д. Ген, кодирующий этот белок, встроенный в генетический аппарат E.Coli или дрожжевой клетки, индуцирует образование этого белка, который в очищенном и концентрированном виде представляет высокоэффективную абсолютно безвредную вакцину. Получена рекомбинантная субъеди­ничная вакцина, в которой основ ной протективный иммуноген — белок VP2, продуцируе­мый в высоко иммуногенной форме в дрожжах Scecharomyces cerevisiae. Рекомбинантный белок VP2 в виде мясляно-эмульсионной вакцины индуцировал ВНА и ELISA регистрируе­мые AT у кур, которые передавались потомству и предохраняли цыплят от заражения виру­лентным вирусом. Рекомбинантная субъединичная вакцина индуцировала АТ-ответ такого же уровня, который наблюдался у кур при введении им живого вируса. Поэтому считают, что рекомбинантный субъединичный препарат впоследствии должен вытеснить используемые в повседневной практике инактивированные вакцины. При вакцинации 1-сут цыплят наиболее выраженный иммунитет (не менее, чем у 90% привитых) наступает при введении живой вакцины, а спустя 24 дня - инактивированной. Прививка кур в 8-12-нед возрасте живой вакциной усиливает иммунный ответ на введение инактивированной вакцины в более поздний период. Создан высокоиммуногенный пептид VP2 вируса ИБ в виде агрегированной формы, состоящей из нескольких пептидов.

Кроме вакцинопрофилактики за рубежом в лабораторных условиях с положительными результатами были испытаны монАТ, полученные, в основном, на эпитопы протеина VP2 (VP2a и VP2b), ответственные за индукцию ВНА, а также на протеин VP3. AT на VP2a и VP2b предупреждали развитие инфекции у зараженных SPF-цыплят в 100% случаев, а на VP3 - всего лишь в 22%.

Серологическая оценка поствакцинального иммунитета. Динамика изменения титра поствакцинальных AT на живую и инактивированную вак­цину по данным ИФА и РН имела сходный характер. Преципитирующая активность в агаровом геле регистрировалась выше лишь в ИФА-позитивных сыворотках и пробах с определенным титром ВНА (90).

Лучшие результаты получены при выпаивании живой вакцины в 2-5-нед возрасте, а в 20-нед возрасте - от применения инактивированной вакцины. В ФРГ (Дессау) при сравнении аэрозольной и пероральной иммунизации получены сходные результаты. Пассивно иммун­ные цыплята были устойчивы к заражению вирусом ИБ в возрасте 7, 14, а иногда и свыше 20 да в зависимости от уровня и длительности сохранения материнских AT. Пассивные ПА выявляли до 13 нед возраста у цыплят, полученных от 1-кратно вакцинированных птиц. AT сохранялись на 4 нед дольше, если кур вакцинировали дважды. Однако это не увеличивало уровня иммунитета. У цыплят активный иммунитет развивался недостаточно, если уровень приобретенных материнских ВНА у них был около 7 1оg. Если тиры AT были ниже этого уровня, то вакцинация приводила обычно к репликации вируса в фабрициевой сумке при сильном ее поражении и последующем развитии активного иммунитета.

Установлено, что инкубационные яйца, полученные из хозяйств, неблагополучных по ИБ, невосприимчивы к этому агенту. Эта особенность была использована для определения степени благополучия птицеводческих хозяйств в ФРГ. Когда от вируса ИБ погибало свыше 75% зараженных эмбрионов, считали, что они полностью восприимчивы к вирусу, а хозяй­ства, из которых были получены яйца, относили к полностью благополучным. Партии инку­бационных яиц, где гибель эмбрионов составляла 25-75% и 0- 25%, относили соответствен­но к частично восприимчивым и полностью невосприимчивым, а хозяйства - к числу небла­гополучных по ИБ. Ввиду того, что вирус ИБ поражает иммунную систему птиц, ответст­венную за выработку гуморального иммунитета, косвенным показателем благополучия хо­зяйства могут служить результаты исследования продукции накопления AT в сыворотке крови птиц после вакцинации их против ИБ. В этом случае в неблагополучном по ИБ хозяй­стве вакцинация против ИБ не вызывает образования и накопления AT, при этом у 30-80% обследуемых птиц титры ГА были ниже 1:8, а индекс нейтрализации - ниже 2 lg.

В США для профилактики ИБ все поголовье в возрасте 14 дн прививают живой вакци­ной Burgine, которую дают с питьевой водой. Ревакцинацию проводят в 35-дн возрасте. Третья вакцинация - в 17 нед масляной адсорбатвакциной. По сравнению с живой она га­рантирует более продолжительную защиту родителей и более высокий титр материнских AT. Применяющаяся в Италии и Югославии на родительском стаде кур эмульсин-вакцина приводит к образованию высокого уровня ПА. Цыплята, полученные от таких кур, также имеют высокий уровень гуморальных AT. Введение на фоне базового иммунитета от живой вакцины инактивированной вакцины обеспечивает формирование у цыплят в первые недели жизни высокого уровня невосприимчивости, обеспечиваемого накоплением в яйце значи­тельного количества материнских AT (титр их 1:4000 в РН в культуре клеток). Последую­щее введение масляной вакцины доводит этот показатель до 1:100000. Активную иммуни­зацию целесообразно проводить только при содержании в крови AT в титрах не ниже 1:64.

В настоящее время контроль формирования поствакцинального иммунитета против ИБ целесообразно осуществлять с помощью РН и РДП. У всех цыплят, привитых живой вакци­ной, AT в сыворотке крови появлялись начиная с 3-4 нед и обнаруживались в РН и РДП. ПА после вакцинации в 4-5 нед возрасте они выявлены в среднем у 67,8% кур до 46-нед воз­раста. Материнские AT сохранялись у цыплят до 10 дн (в РДП) и до 20 дн (в РН). У 80-100% цыплят, полученных от вакцинированных кур, обнаруживали ПА, но к 17-дн возрасту они исчезали. Материнские AT передавались трансовариально и выявлялись в сыворотке крови цыплят в 1-,11-,19- и 25-дн возрастах у следующего количества птиц: в РН - у 86, 72, 30 и 22% (титр 1:16 и выше), в РДП - у 88, 69, 5 и 0% соответственно. У 1-сут цыплят положительная РН составляла 52,5%, что свидетельствовало о наличии материнских AT. В возрасте 30 дн число серопозитивных цыплят снижалось до 4,7%. Цыплята, полученные из яиц ферм, где болезнь регистрировалась, содержали материнские AT в течение 15 дн.

Как постинфекционные, так и поствакцинальные AT выявляются в РН. Так, при зара­жении молодых чувствительных цыплят вирусом ИБ получают хороший серологический от­вет. Определен иммунный ответ у цыплят различного возраста через 3 нед после их зараже­ния вирусом. Цыплята, иммунизированные в 4-нед возрасте, имели ИН 3,5, в то время как ИН у 3-дн вакцинированных цыплят находился в более низких пределах - 1,5-2. Взрос­лые птицы, так же как и молодые цыплята, слабо реагируют на вводимый АГ, возможно, из-за отсутствия функциональной активности бурсы Фабрициуса. Птица считается устойчивой к инфицированию вирулентным вирусом при титре AT в РН, равном 2 lg и выше, а в РДП -не ниже 1:8. 100%-ную устойчивость цыплят наблюдали через 3 дня после их вакцинации вирусом Си-1М. Титр AT у них в РН составлял 1:8, через 7 дн - 1:8000.

Что касается защитной роли пассивных материнских AT у цыплят, полученных от кур-реконвалесцентов или иммунизированных вакцинами, то в этом отношении имеется одно­значная трактовка: пассивные AT задерживают размножение вируса независимо от пути его инокуляции в КЭ. Передача родительских AT цыпленку подобным образом защищает его от заражения. Для оценки эффективности иммунитета, стимулированного вакцинами на сте­пень разрушения бурсы, предложено использовать морфометрический анализ. Для этого измеряют общую площадь и интегральную АГ плотность соседних фолликул на окрашен­ных гемотоксилинэозином гистологических срезах бурсы 3-х групп цыплят: невакциниро­ванных незараженных, невакцинированных зараженных вирулентным вирусом (II), вак­цинированных зараженных вирулентным вирусом (III). Заражение вирулентным вирусом проводили через 15 дн после вакцинации, а морфометрический анализ - через 10 дн после заражения. Общая площадь 10 фолликул у цыплят I, II и III групп составляла соответствен­но 6,25-10⁴, 5,54-10⁴ и 2,27-10⁴ мк, а интегральная АГ плотность - соответственно 392-10², 254-10² и 147-10² ед (68). Для определения титра AT и АГ ИБ предложен также метод ВИ-ЭФ. В качестве АГ используют гомогенат бурс от больных птиц в разведении 1:32 и сыво­ротки от переболевших и вакцинированных птиц. Метод ВИЭФ может быть с успехом ис­пользован для экспресс-диагностики ИБ и быстрой оценки иммунного статуса птиц.

Семейство: Herpesviridae.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: