Принципы и методы выделения чистых культур. Ферменты бактерий, их идентификация. Внутривидовая идентификация (эпидемиологическое маркирование).

Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Под микробной колонией подразумевает­ся потомство бактерий, возникающее в результате размно­жения одной микробной клетки.

Выделение чистой культуры микробов является обяза­тельным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических культуральных, биохимических и антигенных свойств, по со­вокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение по­лучил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине пита­тельной среды.

Очень широко применяются элективные питательные сре­ды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных.

При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если матери­ал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой.

При посеве на скошенный мясо-пептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для
взятия бактериальной петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынима­ния пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха.

Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой.

При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой —IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют I и III или I и II пальцами. Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. За­тем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находяще­гося на ней материала. Линию посева начинают с того ме­ста, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов. Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользо­ваться вместо петли тампоном или шпателем.

Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.

Для изуче­ния свойств колоний микробы культивируют на плотных пи­тательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объ­ективом малого увеличения и с суженной диафрагмой.

Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции.

Величина колонии определяется ее диаметром, В за­висимости от диаметра различают колонии точечные (диа­метр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр 4—6 мм и более).

Форма колонии бывает правильная — круглая, непра­вильная — амебовидная, ризоидная — корневидная, напоми­нающая переплетающиеся корни деревьев.

Характер контура края определяют при рассмотре­нии колонии под лупой или микроскопом с малым увеличе­нием. Различают ровные края в виде четко выраженной ли­нии и неровные (фестончатый, волнистый, бахромчатый).

Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии нево­оруженным глазом или с лупой при рассматривании сверху и сбоку. Различают (каплеобразные, куполообразные, конусообразные, колонии с вдавленным центром, плоские).

Поверхность коло­ний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозна­чают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый». Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссо­циации. Явление диссоциации у патогенных микробов на­блюдается под действием антибиотико- и химиотерапии, фак­торов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также при попадании микроба во внешнюю среду.

Цвет колонии определяется пигментом, который проду­цирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды мик­робов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные идр.

Структура колоний определяется в проходящем све­те при слабом увеличении микроскопа.

По характеру структуры различают следующие виды ко­лоний:

1) гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

2) зернистые;

3) нитевидные или волокнистые, характеризующиеся на­личием длинных, густо переплетающихся нитей в толще колонии.

Консистенцию колонии исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей.

По характеру консистенции колонии бывают:

1) пастообразные, легко снимающиеся и размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;

2) вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей;

3) волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соот­ветствующей величине и форме колонии;

4) хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.

На жидких питательных средах характер роста мик­робов менее разнообразен, чем на плотных питательных средах. Однако и здесь выявлены следующие формы роста бак­терий.