Гистаминоподобное вещество

Гистаминоподобное вещество содержится в ССЖ МП. Поскольку в литературе отсутствуют сведения и природе этого вещества, трудно судить о его биологической роли при гирудотерапии. Однако, в месте приставления пиявок наблюдается типичная воспалительная реакция. Очевидно, такое проявление местного действия ССЖ МП можно отнести на счет гистаминоподобного вещества [8].

ГИРУДИН

Профессор Королевского колледжа г. Бирмингема (Англия) Джон Хайкрафт (J.B. Haycraft (1884) был первым, кому удалось получить из МП экстракт, оказывающий антикоагулирующее действие in vivo и in vitro. Хотя J.B. Haycraft не обнаружил желез, вырабатывающих

противосвертывающее вещество, он показал, что их необходимо искать в передней части тела МП. И в этом его большая заслуга и приоритет.

Название «гирудин» он получил в 1904г. в результате работ F.Franz, выполненных в 1903г. в лаборатории Y. Jacoby (цит. по [1], стр.159).

Гирудин – это 65- или 66-членный пептид, содержащий три дисульфидные связи, главная особенность которого – наличие сульфатированного тирозина в положении 63. Гирудин образует семейство из более чем 20 изоингибиторов, различающихся длиной полипептидной цепи и заменами некоторых аминокислотных остатков [12]. Степень их гомологии составляет ~ 20%, но не все изоформы гирудина обладают антитромбиновой активностью ([1], стр.159).

Полная первичная структура гирудина была установлена в 1976г. [13]. Позднее она была подтверждена [14], а в 1985г. было установлено расположение дисульфидных связей в молекуле гирудина [15].

В 1986 г. появились первые публикации по получению рекомбинантного десульфатированного гирудина [16].

Третичная структура ингибитора представлена тремя функциональными образованиями: компактным доменом вблизи N-конца молекулы, стабилизированным тремя дисульфидными связями, формирующими «ядро» (остатки 6-39), коротким пептидом (остатки 1-5) и протяженным С-концевым хвостовым доменом (остатки 40-65). Короткий N -концевой фрагмент (остатки 1-5) и С-концевой домен подвижны относительно «ядра».

Гирудин взаимодействует с активным центром тромбина, связываясь не с карманом первичного связывания, а вблизи него.

N -концевой пептид образует короткую параллельную β-структуру с сегментом тромбина (остатки 214 - 219), близким к его каталитическому центру. Гидрофобные остатки первых трех N -концевых аминокислот, размещаясь в щели активного центра, блокируя доступ субстратов.

Отрицательно заряженный C-концевой фрагмент ингибитора (остатки 54-65) связывается с положительно заряженным и гидрофобным фрагментами фибриногенсвязывающего экзосайта фермента.

Таким образом, при взаимодействии с тромбином гирудин закрывает два участка активного центра, важных для связывания фермента с фибриногеном, субстратсвязывающий и анионсвязывающий. Это двухцентровое взаимодействие называют мостиковым связыванием, специфичным для тромбина (17).

Компактный глобулярный N -концевой домен гирудина, хотя и осуществляет слабый контакт с поверхностью тромбина путем образования двух ионных пар (Asp5 ингибитора - Arg 221 фермента и Glu 17 ингибитора - Arg 173 фермента) и двух водородных связей. Тем не менее, эти контакты препятствуют доступу макромолекулярных ингибиторов и субстратов к активному центру фермента [18].

Таким образом, очевидно, что гирудин является уникальным ингибитором тромбина. Он единственный из ингибиторов, способный в пикомолярной концентрации блокировать активность протеолитического фермента. Уникальная специфичность гирудина объясняется неизвестным ранее механизмом множественных взаимодействий между ферментом и ингибитором.

В отличие от известных ингибиторов сериновых протеиназ, которые контактируют преимущественно с областью каталитически активного центра фермента, область взаимодействия гирудина с тромбином удалена от его каталитического центра.

Гирудин образует исключительно прочный комплекс с тромбином, и молекулярной основой такой прочности является большое количество контактов между тромбином и гирудином, которые обнаруживаются при рентгеноструктурном анализе соответствующих кристаллов. Образование комплекса тромбин-гирудин протекает по двухстадийному механизму, который может быть представлен следующей схемой [19]:

E + I → EI → EI*,

где Е и I – тромбин и гирудин соответственно. Первая стадия - взаимодействие С-концевого фрагмента гирудина с тромбином, зависящее от ионной силы раствора и предполагающее образование комплекса EI. Оно не затрагивает субстратсвязывающий участок активного центра тромбина. Это участок вовлечен во вторую стадию взаимодействия гирудина с тромбином с образованием комплекса EI*.

Исследования в области получения рекомбинантного гирудина привели к появлению различных структурных вариантов природного ингибитора, общим для которых является наличие в молекулах остатка несульфатированного Tyr63. что и определило их общее название «десульфогирудины» или «дезирудины» [20].

В отличие от природного рекомбинантные гирудины обладают меньшим сродством к тромбину, хотя антикоагулянтные свойства у них такие же, как у природного ингибитора. Гирудин ингибирует не только свободный тромбин в растворе, но и фермент, связанный с фибириновым сгустком [4]. Аспекты клинического применения гирудина разнообразны, ограничением является только использование высоких доз гирудина, при которых возможна повышенная кровоточивость у больных.

Ингибирование активности тромбина - не единственная функция гирудина. В его присутствии замедляется реакция активации тромбином факторов свертывания V, VIII, XIII. Гирудин препятствует реакции высвобождения и агрегации тромбоцитов, ингибируя связывание тромбина кровяными пластинками. Гирудин вызывает диссоциацию комплекса тромбина со специфическими белками – рецепторами на тромбоцитах, так как у тромбина сродство к гирудину выше, чем к высокоаффинным рецепторам на тромбоцитах. Он лишает тромбин способности повышать антикоагуляционный и фибринолитический потенциалы крови при внутривенном введении крысам.