Культивирование аэробных микроорганизмов

Культивирование на поверхности плотных и жидких сред. В этом случае микроорганизмы выращивают на поверхности плот­ной среды или в тонком слое жидкой среды, и кислород поступает к ним непосредственно из воздуха. При поверхностном культи­вировании важно увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. Для этого среды наливают тонким слоем в посуду с широким дном — чашки Петри, колбы Виноградского, матрацы (см. рис. 30). В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэро­бы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. По­верхностное культивирование микроорганизмов применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности.

Глубинное культивирование в жидки х средах. Все способы глубинного культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха. Следует иметь в виду, что при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микро­организмов в толще среды,- ее необходимо постоянно аэрировать. При аэрировании среды учитывают два показателя: интенсивность аэрации и степень аэрации. Интенсивность аэрации характеризу­ется скоростью растворения кислорода в единице объема культу-ральной среды за единицу времени. Степень аэрации — это объем воздуха, продуваемый через определенный объем среды за едини­цу времени.

Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования — выращивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб или лробирок со скоростью 100—200 и более оборотов в минуту. Чем больше скорость вращения, тем больше соприкосновение среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Увеличить аэрацию среды при работе на одной и той же качалке можно уменьшени­ем объема среды или применением колб с отбойниками — вдавли­ваниями внутрь в виде 4—8 отростков 2—3 см длиной При вращении колб с отбойниками поверхность со­прикосновения среды с воздухом заметно увеличивается благода­ря разбрызгиванию жидкости Чем больше отбойников, тем силь­нее разбрызгивание жидкости, тем выше аэрация.

Интенсивность аэрации при выращивании микроорганизмов на качалках характеризуют, как правило, скоростью поглощения кислорода водным раствором сульфита. Раствор сульфита налива­ют в сосуды для культивирования вместо питательной среды и че­рез определенные промежутки времени.измеряют количество окис­ленного сульфита в тех же условиях аэрации, при которых выращи­ваются исследуемые микроорганизмы. Сульфитный метод не дает возможности определить концентрацию кислорода в культуре. Концентрацию кислорода, рас­творенного в культуральной жидкости, определяют полярографически.

Помимо перемешивания аэрировать культуру микроорганизмов можно про­дуванием через толщу среды стерильно­го воздуха. Этот способ часто использу­ют в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии при по­лучении биомассы и различных продук­тов жизнедеятельности микроорганиз­мов — антибиотиков, ферментов, кислот. Скорость протекания воздуха через сре­ду необходимо контролировать. Для это­го используют различные приборы: га­зовые часы, ратометры и др. В ферменте­рах количество пропускаемого воздуха поддерживают на заданном уровне авто­матически. Воздух стерилизуют путем прохождения через активированный дре­весный уголь, стеклянную вату, пропи­танную антисептиком, или специальные ткани из полимеров. В лабораторных

опытах, когда объем и скорость поступления воздуха невелики, используют заранее простерилизованные ватные фильтры. Для возможно более сильного распыления воздух пропускают через мелкопористые пластинки ■— барботеры; в лабораторных опытах с этой целью применяют стеклянные фильтры.

Для аэрации культур микроорганизмов, как правило, исполь­зуют обычный воздух. Продувание сред кислородом в лаборатор­ных условиях не рекомендуется, так как чрезмерное насыщение среды кислородом (до 40 мг/л) может привести к угнетению роста микроорганизмов. В ферментерах принудительную аэрацию обыч­но совмещают с механическим перемешиванием среды мешалка­ми, скорость вращения которых может достигать сотен и даже тысяч оборотов в минуту. Выращивание в вы соком слое среды. Это наиболее простой, способ ограничения доступа воздуха к клеткам микроорганизмов. Жидкую среду наливают в сосуды для культивирования высоким слоем. Так как нельзя стерилизовать среды, если они занимают бо­лее половины высоты сосуда, часть среды стерилизуют отдельно и стерильно доливают ею сосуд для культивирования сразу же после посева. Непосредственно перед посевом среду кипятят иди прогревают на кипящей водяной бане 30—40 мин, затем быстро охлаждают, чтобы в ней не успел раствориться кислород воздуха, и вносят на дно посевной материал.

Культивирование в вязких средах. Диффузия кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости. Поэтому в вязких средах, таких.как картофельная или среды с кукурузной либо другой мукой, хорошо развиваются некоторые облигатные анаэробы, например, возбудители маслянокислого или ацетонобу-тилового брожения. Вязкость жидких сред легко увеличить, если добавить к ним 0,2—0,3% агара.

Выращивание в толще плотной среды. Этим приемом пользу­ются для получения изолированных колоний при выделении чис­тых культур или определении численности анаэробных микроор­ганизмов. Посевной материал вносят в расплавленную и остужен­ную до 48—50° агаризованную, желательно осветленную среду, тщательно перемешивают и оставляют в пробирках или перелива­ют стерильной пипеткой в заранее простерилизованные трубки Бурри или чашки Петри. Поверхность среды в пробирках зали­вают парафином. Трубки Бурри — это стеклянные трубки длиной 20—25 см, диаметром 1,0—1,5 см. Трубки стерилизуют, закрыв оба конца ватными пробками. Перед посевом ватную пробку у од­ного конца заменяют стерильной резиновой, через другой конец трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают также резиновой пробкой (рис. 38).

При использовании чашек Петри для выращивания анаэробов засеянную агаризованную среду наливают в крышку чашки и, по­сле того как среда застынет, плотно прижимают к ее поверхно­сти дно чашки. Зазор между стенками дна и крышки, где среда соприкасается с воздухом, заливают стерильным парафином

Выращивание в анаэростатах. Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатах — вакуумных металлических камерах, снабженных манометром. Анаэростатом может служить обычный вакуумный стеклянный эксикатор. Из анаэростата от­качивают воздух, а затем, как правило, заполняют его газовой смесью, состоящей из азота (90—80%) и углекислоты (10—20%), до давления порядка 67-Ю³ Па (500 мм рт. ст.). Избыточное дав­ление исключает возможность диффузии кислорода воздуха.

Некоторые строгие анаэробы, например, метанобразующие бактерии, ацетогены, некоторые грибы, расщепляющие целлюлозу, микроорганизмы рубца жвачных животных, погибают даже при кратковременном контакте с кислородом воздуха. Работа с таки­ми микроорганизмами представляет большие трудности и требует специального оборудования. Для культивирования строгих (обли-гатных, экстремальных) анаэробов необходимо применять мето­ды, позволяющие исключать молекулярный кислород из сред культивирования, создавать и поддерживать в них низкий окисли­тельно-восстановительный потенциал (ОВП). С этой целью ис­пользуют технику, разработанную профессором Хангейтом (Hun-gate): 1) среды для выращивания микроорганизмов и все добавки в них готовят перед автоклавированием с максимальной защищен­ностью от контакта с кислородом (кипячение и т. д.); 2) после авто-клавирования среды и добавки для них немедленно охлаждают в токе стерильного газа, освобожденного от следов кислорода про­пусканием над медными стружками, нагретыми до 350—400 °С; 3) до посева микроорганизмов в среды добавляют восстановители (цистеин, сульфид натрия, тиогликолат в щелочной среде) для хи­мического поглощения следов кислорода, диффундирующего в со­суды для культивирования даже через резиновые пробки; 4) по­севы, разлив сред, в том числе агаризованных, проводят в токе стерильного газа, не содержащего кислорода; 5) микроорганизмы выращивают и поддерживают в герметически закрытых сосудах, в атмосфере бескислородного газа, часто под давлением для ис­ключения проникновения воздуха; 6) все шланги, по которым идут газы для продувки сосудов, должны быть из специальной ре­зины, со слабой степенью диффузии кислорода воздуха, или за­менены на металлические трубки; 7) все пересевы и добав'ки в среды проводят с помощью шприцев, продутых газом, не содер­жащим кислорода.

Степень поглощения кислорода и восстановленности среды оп­ределяется окислительно-восстановительным потенциалом Eh, ко­торый может быть измерен электрометрически на потенциометре или с помощью индикаторных красителей, например, резазурина, феносафранина, нейтрального красного и т. д., изменяющих ок­раску при изменении Eh. Особенно удобен резазурин, который добавляют к средам в концентрации 0,0001 % и стерилизуют вме­сте с минеральными компонентами среды. В окисленной форме он окрашен в голубой цвет, при восстановлении цвет меняется на слабо-розовый, полностью восстановленная форма бесцветна. Ре-зазурин изменяет окрраску при значениях ОВП, близких к—420" мВ, феносафранин — в области —252 мВ.

Для культивирования анаэробов предложены специальные ка­меры и система ГазПак (ОазРак), образующая газы (водород и СОг) в замкнутом пространстве и эффективно поглощающая кис­лород. В качестве поглотителя кислорода в лабораторной практи­ке используют щелочной раствор пирогаллола, дитионитанатрия, металлическое железо и некоторые другие реактивы. При этом необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и объем замкнутого пространства, в котором выращивают микроор­ганизм. Например, на каждые 100 мл емкости используют 1 г пи­рогаллола и 10 мл 2,5 н. раствора гидроксдода натрия. Поскольку многие анаэробы нуждаются в углекислоте, пирогаллол часто растворяют не в щелочи, а в насыщенном растворе бикарбоната натрия. Полноту поглощения кислорода контролируют раствором, содержащим окислительно-восстановительный индикатор. Для приготовления раствора смешивают равные объемы 0,024%-ного ЫаОН, 0,015%-ного водного метиленового синего и 6%-ной глю­козы; в качестве антисептика к раствору добавляют тимол. Перед использованием в пробирку наливают 5 мл смеси и нагревают на кипящей водяной бане до обесцвечивания, быстро охлаждают и помещают в анаэростат. В анаэробных условиях раствор остается бесцветным.

В качестве восстановителя чаще всего используют сульфид и тиогликолат натрия. Обычно готовят 1%-ные растворы этих вос­становителей в 5%-ном растворе бикарбоната натрия, стерилизу­ют автоклавированием и добавляют к средам сульфид натрия из расчета 250—500 мг/л, а тиогликолат — до 250 мг/л среды. Вос­становители используют в концентрациях, не влияющих иа рост микроорганизмов.

Для культивирования строгих анаэробов предложены специ­альные камеры, заполненные газовыми смесями (чаще всего 90%' N2, 5% С0₂ и 5% Н₂), которые содержат внутри все необходимое для выполнения микробиологических работ, включая термостат. Это оборудование сложно и дорого, но оно имеет одно неоспори­мое преимущество —■ контакт клеток с кислородом воздуха оста­ется минимальным почти на всех этапах работы.

Билет №16