Количество клеток в1мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле

М — количество клеток в 1 мл; а — среднее число колоний при высеве разведения, из которого сделан высев; V — объем суспензии; 10" — коэффициент разведе­ний.

Определение количества клеток высевом в жидкие среды (ме­тод предельных разведений)- Вопрос.для подсчета мо, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах. В пробирки с жидкой средой вносят строго измеренный объем из различных разведений исследуемого суб­страта. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают по табл.Мак-Креди наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исследуе­мого субстрата. Этапы: (1) приготовление разведений как и для чашечного метода.

(2) посев. (3) регистрация результатов. Сте­рильную среду, обеспечивающую рост мо, числен­ность которых хотят определить, предварительно разливают в пробирки (колбы) и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого разведения или из 4—5 последних, причем каждое разведение вы­севают в 3—5 параллельных ряда пробирок. Количество посевного ма­териала везде одинаково и, как правило,1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблет­ся от 2 до 15 суток и зависит от скорости роста мо. После инкубации регистрируют рост мо, используя различные показатели: помут­нение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде определенных метаболитов.

Наиболее вероятное количество клеток в единице объема рас­считывают по таблице Мак-Креди. Для этого первона­чально составляют числовую характеристику, которая включает три цифры. Первая слева -число пробирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры -число пробирок, в которых отмечен рост мо при засеве их из двух последующих разведений. Затем по таблице на­ходят наиболее вероятное число мо, соответствую­щее данному значению числовой характеристики. Количество мо в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ

1.взвешивание. для оценки роста мо в жидких питательных средах. Метод не может быть использован при культивировании на средах, в состав которых входят соединения, не растворимые в воде. Этапы: 1.Доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения. -фильтры, предварительно положенные в открытую чашку Петри, или центрифужные пробирки помещают в сушильный шкаф и высушивают в течение 1—2 ч при 80—85° и 90—100° соотв.Затем чПетри с фильтрами или центрифужные пробирки вынимают из сушильного шкафа и пе­реносят в эксикатор с безводным СаСl или конц.H₂SO₄. Эксикатор ставят около аналитических весов, на которых будет проводиться взвешива­ние. Через час фильтры (центрифужные пробирки) взвешивают с точностью до 0,0001 г. 2.Отделение микроорганизмов от среды возможно центрифугированием или фильтрованием.

3.Определение биомассы. Чтобы определить массу су­хих клеток, центрифужную пробирку или фильтр с осадком мо помещают в сушильный шкаф, высушива­ют и взвешивают.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК И БИОМАССЫ НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ-измерение уменьшения количества света при его прохождении через суспензию клеток. В определен­ных пределах оно обусловлено рассеянием све­та клетками и пропорционально их концентрации. Величина этого показателя зависит от:а) формы и размеров кле­ток, б)оптических свойств культуральной среды, в)длины волны па­дающего света и т. д.. Поэтому нефелометрический метод приго­ден лишь для тех мо, рост которых вызывает рав­номерное помутнение среды и не сопровождается заметным изме­нением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений.Пит.среда должна быть оптически прозрачной.

Изменение интенсивности света при прохождении через сус­пензию клеток измеряют с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК) или спектрофотометра, выбирая длину волны (обычно540—650 нм), при которой поглощение света данной суспензией клеток является min.

В ряде случаев количество клеток в суспензии бывает доста­точно определить визуально путем сравнения со стандартом мут­ности. Стандарты мутности, выпускаются государственным НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препа­ратов им. Л. А. Тарасевича-это взвесь частиц стекла пирекс в dist.воде. За единицу стандарта мутности общего назначения условно принята мутность суспензии в физиологическом растворе бактерий — возбудителей тифа.

Билет №14