 |
Закрепление теоретического материала.
|
|
|
|
Судебно-медицинская генетическая экспертиза
На разрешение экспертов поставлен следующий вопрос:
Является ли О. отцом ребенка Р.
«16 мая 2007 года взяты образцы крови из вен локтевого сгиба в количестве 2 мл. в пробирки с 2% раствором цитрата натрия. Образцы крови у матери, ребенка и предполагаемого отца взяты медицинской сестрой отделения молекулярно-генетических исследований ГОУЗ Бюро СМЭ Ростовской области Ф.И.О. в процедурном кабинете Н-ского отделения № 1 БСМП-2 г. Ростова-на-Дону в присутствии медицинской сестры и медицинского регистратора отдела сложных экспертиз ГОУЗ Бюро СМЭ Ростовской области Ф.И.О. (в соответствии со ст. 35. Федерального Закона № 73 от 31.05.2001. «О государственной судебно-экспертной деятельности в Российской Федерации»).
Образцы крови в пробирках, маркированных «М», «Р», «О» помещены в контейнер, опечатаны, опломбированы (пломба AM №…) и переданы зав. отделением молекулярно-генетических исследований ГОУЗ Бюро СМЭ Ростовской области.
Исследованию подвергнуты образцы жидкой крови нижепоименованных лиц:
1. Заявленного отца О.
2. Матери М.
3. Ребенка Р.
ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ ЧАСТЬ
Метод исследования. В основе метода исследования лежит изучение аллелей, уникально наследуемых ребенком от биологических родителей, по ряду несцепленных между собой полиморфных локусов. Исследованию подвергается дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), выделенная из клеток крови обследуемых лиц. У каждого человека клетки крови и различных тканей (костей, слюны, кожи, зубов, спермы и др.) содержат абсолютно одинаковую ДНК, которая остается постоянной на протяжении всей жизни, не подвергаясь изменениям.
При проведении полимеразной цепной реакции (НЦР) по исходной матрице ДНК происходит высокоспецифичная амплификация (увеличение количества копий в миллионы раз) аллелей исследуемых локусов. Это позволяет провести электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов ДНК и идентифицировать соответствующие этим фрагментам аллели полиморфных локусов.
|
|
|
В генотипе каждого ребенка присутствуют аллели, унаследованные от биологических родителей, то есть совпадающие с аллелями отца и матери. Сравнение генотипов ребенка и матери позволяет установить, какие именно аллели унаследованы ребенком от биологического отца («отцовская панель аллелей «).
Вывод об исключении отцовства делается, если в генотипах ребенка и предполагаемого отца отсутствуют совпадающие аллели даже по отдельным локусам.
При наличии совпадающих аллелей по всем исследованным локусам у ребенка и предполагаемого отца делается вывод о возможности получения ребенком наследственного материала от обследуемого (неисключение отцовства).
Результаты исследования логически неопровержимы лишь в случаях исключения отцовства. В случаях же неисключения., поскольку профиль генотипов по исследованным локусам не является, в общем, уникальным для каждого человека (например, у однояйцевых близнецов профили генотипов идентичны), мощность исследования оценивается средствами теории вероятностей и математической статистики на основании данных о встречаемости аллелей в популяции.
Любой случай неисключения отцовства, независимо от количества исследованных локусов, не является логически неопровержимым: всегда существует вероятность случайного совпадения аллелей в сравниваемых образцах ДНК.
Выделение ДНК и проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК из представленных образцов крови выделены фенол-хлорофорным способом по стандартной методике [1]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием термо-циклеров МС-2 («ДНК-технология «, Россия), внося в реакционные смеси (общий объем 25 мкл) 1 мкл полученных препаратов ДНК. ПЦР осуществляли с использованием соответствующих наборов и протоколов [2], исследуя независимо наследуемые молекулярно-генетические системы, перечисленные в таблице 1.
|
|
|
Анализ продуктов амплификации. Амплифицированные фрагменты ДНК анализировали методом электрофоретического разделения фрагментов ДНК в полиакриламидных гелях (2). В качестве маркеров молекулярных размеров использовались 100-п.н. GenRuler DNA Ladder fins ( «Fermentas», Литовская республика), Mspl-гидролизаты плаз-миды pBlueScript, а также аллельные «лестницы» для локусов, содержащие набор фрагментов известного размера. После завершения электрофоретического разделения ампли-фицированных фрагментов ДНК окрашивание гелей проводили раствором этидиума бромида с последующей визуализацией и фотографией в проходящих лучах УФ света с использованием аппаратуры Gel Doc® 1000/2000 гель-документирующей системы (BIORAD).
Для численной оценки результатов генетических экспертиз случаев спорного родства осуществляли с использованием компьютерной программы Ptndex (Paternity INDEX) версия 0.3.
Идентификацию аллелей исследованных полиморфных локусов осуществляли по размерам амшшфицированных фрагментов ДНК. Для точного определения размеров фрагментов ДНК использовали либо аллельные «лестницы «в случае локусов микросатте-литов, либо маркеры молекулярных масс в сочетании с компьютерной программой «Quantity One® «, позволяющей рассчитывать размер аллеля (в парах нуклеотидов) по длине пробега в геле амплифицированного фрагмента ДНК.
Для точного определения размеров фрагментов ДНК использовали маркеры молекулярных размеров в сочетании с компьютерной программой, позволяющей рассчитывать размер аллеля (в парах нуклеотидов) по длине пробега в геле амплифицированного фрагмента ДНК. В сомнительных случаях, при невозможности точно идентифицировать аллель, его относили к тому из возможных табулированных (больше либо меньше по размерам), частота встречаемости которого в русской популяции максимальна [2]. Данная схема позволяла «затрубить «такой параметр, как популяционная частота встречаемости «отцовской панели аллелей». Результаты генотипирования приведены в таблице
|
|
|
2. Таблица 1.
Использованные в настоящем исследовании полиморфные микросателлитные локусы генома человека
| Локус | Хромосомная локализация | Длина повторяющейся единицы (нуклеотидных пар) |
| PAH-STR* | 12q22-q22.4 | 4 (ТСТА) |
| vWFII | 12р13.2 | 4(AGAT) |
| D19S253 | 19р13/1 | 4 (САСА) |
| D5S818 | 5q21-23 | 4 (AGAT) |
| D7S820 | 7ql 1.2 1-23 | 4 (AGAT) |
| D8S1179 | 8q24. 1-24.2 | 4 (ТСТА) |
| D3S1358 | З р21.3 | 4 (ТСТА) |
| L1POL (LPL) | 8р22 | 4(АААТ) |
| FGA/F1BRA | 4q28 | 4 (ТТТС) |
| CSF1PO | 5q33.3-q34 | 4 (AGAT) |
| CYAR04(CYP19) | 12q21.1 | 4 (АААТ) |
| TH01 | 4 (ТСТА). (TCTG) |
Идентификацию аллелей исследованных полиморфных локусов осуществляли по размерам амплифицированных фрагментов ДНК. Для точного определения размеров фрагментов ДНК использовали маркеры молекулярных размеров в сочетании с компьютерной программой, позволяющей рассчитывать размер аллеля (в парах нуклеотидов) по длине пробега в геле амплифицированного фрагмента ДНК. В сомнительных случаях, при невозможности точно идентифицировать аллель, его относили к тому из возможных табулированных (больше либо меньше по размерам), частота встречаемости которого в русской популяции максимальна [2]. Данная схема позволяла «загрубить» такой параметр, как популяционная частота встречаемости «отцовской панели аллелей». Результаты генотипирования приведены в таблице 2.
Таблица 2.
| .№ | Локус | Генотип отца | Генотип ребенка | Генотип матери | Формула | Частота аллеля | LR | Выбрать |
| РАН-SIR* | 2/4 | 2/4 | 4/4 | 1/2р(2) | р(2)=0,060 | 8,33 | ++ | |
| vWFII | 11/12 | 12/14 | 11/14 | 1/2р(12) | р(12)=0,340 | 1,47 | ++ | |
| D19S253 | 19/21 | 15/19 | 7/15 | 1/2р(19) | р(19)=0,290 | 1,72 | ++ | |
| D5S818 | 10/12 | 8/10 | 8/12 | 1/2р(10) | р(10)=0,110 | 4,55 | ++ | |
| D7S820 | 10/10 | 9/10 | 8/9 | 1/р(10) | р(10)=0,270 | 3,70 | ++ | |
| D8S1179 | 11/13 | 11/13 | 13/13 | 1/2р(11) | р(11)=0,090 | 5,56 | ++ | |
| D3S1358 | 14/16 | 16/17 | 15/17 | 1/2р(1б) | р(16)=0,310 | 1,61 | ++ | |
| LIPOL (LPL) | 10/11 | 11/12 | 12/12 | 1/2р(11) | р(11)=0,240 | 2,08 | ++ | |
| FGA/FIBRA | 23/26 | 22/23 | 22/27 | 1/2р(23) | р(23)=0,170 | 2,94 | ++ | |
| CS.F1PO | 10/11 | 11/12 | 9/12 | 1/2р(11) | р(11)=0,350 | 1,43 | ++ | |
| CYAR04(CYP19) | 6/6 | 6/7 | 7/11 | 1/р(6) | р(6)=0,400 | 2,50 | ++ | |
| TH01 | 9/9 | 6/9 | 6/10 | 1/р(9) | р(9)=0,180 | 5,56 | ++ | |
| Индекс отцовства (Combined Paternity Index, CPI) | ||||||||
| Вероятность отцовства (prior probability pp=0,5) 99,9997% | ||||||||
| Использовались референтные частоты аллелей для русских |
Примечание:
|
|
|
Нумерация аллелей отражает число содержащихся в данном аллеле тандемных повторов
нумерация аллелей не отражает число содержащихся в данном аллеле тандемных повторов, в различных популяционных группах показано существование аллелей 1-8.
Анализ совпадающих аллелей и расчет вероятности отцовства. Как следует из результатов, представленных в таблице 2, выявлены совпадающие аллели во всех исследованных локусах геномов ребенка и остальных обследуемых. Таким образом, генетический материал ребенка мог быть получен по наследству от предполагаемого отца, то есть отцовство гражданина Р. в исследованном спорном случае не исключается.
Выводы:
В целях определения отцовства с использованием метода полимеразной цепной реакции проведено сравнительное исследование индивидуально наследуемых аллелей независимых полиморфных локусов в геномной ДНК, выделенной из клеток крови обследуемых:
1. предполагаемого отца
2. матери
3. ребенка
Выявлены совпадающие аллели во всех исследованных локусах у ребенка и предполагаемого отца (таблица 2). Гражданин О. может являться биологическим отцом ребенка Р. Вероятность истинного отцовства составляет 99, 99997 %, что соответствует словесной формулировке отцовство практически доказано (5,6).
Зав. отделом сложных экспертиз ГОУЗ Бюро СМЭ Ростовской области, к.м.н., доцент – Н.К.Козырева
Зав. отделением молекулярно-генетических исследований ГОУЗ Бюро СМЭ Ростовской области, к.м.н. Г.К.Гончаров
Судебно-медицинский эксперт отделения молекулярно-генетических исследований ГОУЗ Бюро СМЭ Ростовской области, к.б.н. В.М.Сорокин
|
|
|
