 |
Непрерывное культивирование
|
|
|
|
В отличие от периодического культивирования в непрерывных процессах питательная среда подается непрерывно, удаление биомассы и продуктов ее жизнедеятельности также осуществляется непрерывно.
По такому принципу организуются 2 разновидности процессов непрерывного культивирования: процессы полного (идеального) смешения,или хемостатные процессы, и процессы полного вытеснения, или тубулярные процессы.
Установившиеся режимы непрерывного культивирования характеризуются постоян-ством концентрации микроорганизмов и удельной скорости роста популяции.
Непрерывное культивирование проводится в открытой динамической системе, которая может быть как гомогенной, так и гетерогенной. Эта система способна к длительной работе в постоянном установившемся режиме.
Хемостатные процессы непрерывного культивирования
Гомогенные системы идеального смешения
Любой периодический процесс можно перевести в непрерывно-проточный. Непрерывно-проточное культивирование открывает возможности для поддержания постоянных условий роста путем создания такого состава питательной среды, чтобы только один желаемый фактор лимитировал рост. Если в таком процессе плотность популяции определяется химическим составом среды (концентрацией лимитирующего рост фактора), его называют хемостатным культивированием.
Изменяя концентрацию лимитирующего рост фактора, можно изменять плотность популяции, т.е. изменяя скорость разбавления, можно получать режимы, обеспечивающие различную скорость роста популяции. При таком методе, регулируя скорость протока, можно воспроизвести любую точку роста периодической культуры.
В системе идеального смешения микроорганизмы растут в биореакторе при интенсивном перемешивании в культуральной среде, постоянной по своему составу, и, следовательно, в каждый данный момент времени находятся в одном и том же физиологическом состоянии, т.е. в состоянии установившегося динамического равновесия, которое называют «steady state».
|
|
|
В установившемся режиме скорость протока среды, отнесенная к единице объема культуры в ферментере, называется коэффициентом разбавления (D) и равняется удельной скорости роста. При этом культура находится в устойчивом стационарном состоянии динамического равновесия и обладает способностью самопроизвольно автоматически подстраиваться к изменениям условий.
При таком способе культивирования нельзя получить устойчивого состояния только при максимальной скорости роста. В хемостате практически можно только приблизиться к максимальной удельной скорости роста, но не достичь ее, потому что такая скорость роста соответствует критической скорости разбавления, при которой биомасса вымывается из ферментера, что является одним из существенных недостатков хемостата.
Для борьбы с данным явлением возможно использовать комплекс «ферментер-сепаратор». В этом комплексе выходящая из ферментера жидкость сгущается на сепараторе, и часть сгущенного потока непрерывно возвращается в ферментер, остальная часть идет как товарный продукт. Осветленная жидкость сбрасывается в стоки. Основными направлениями использования реципкуляции являются: повышение производительности системы непрерывного культивирования и более полное потребление субстрата из среды.
Одностадийный хемостат применяется при необходимости воспроизвести на протоке любую скорость роста клеток, кроме максимальной.
Двухстадийный хемостат позволяет создавать культуры при скорости роста, близкой к максимальной, и определять условия ее повышения. Для этого в первом ферментере ведется культивирование при скорости разбавления, меньшей чем удельная скорость роста, а во второй подается культура из первого.
|
|
|
Особенности двухстадийного хемостата:
1. Вымывания культуры во втором ферментере не происходит из-за непрерывного поступления культуры из первого. Следовательно, концентрация биомассы никогда не сможет стать равной нулю при любой скорости разбавления. Будет возрастать удельная скорость роста клеток и экономический коэффициент.
2. Концентрация субстрата во втором аппарате всегда меньше, чем в первом. Субстрат расходуется из запаса входящего потока. Это имеет значение в тех случаях, когда важен не только выход биомассы, но и ее чистота.
3. Концентрация биомассы во втором аппарате всегда выше, чем в первом (учитывается прирост биомассы).
4. Двухстадийный хемостат часто оказывается удобней для тех процессов, в которых целевым продуктом является не биомасса, а метаболиты.
Другой широко известный принцип управления процессом – турбидостат. В нем подача питательной среды осуществляется по команде фотоэлектрического элемента, регистрирующего оптическую плотность культуры. Скорость разбавления сама устанавливается в соответствии с заданной плотностью популяции. Этим
турбидостат отличается от хемостата, в котором фиксируется скорость разбавления, соответственно которой устанавливается концентрация биомассы.
Хотя теоретически взаимосвязь между концентрацией биомассы и скоростью разбавления подчиняется одним и тем же закономерностям в хемостате и турбидостате, методы управления процессами различны. Турбидостат позволяет получать максимальные скорости роста, которые применяются при культивировании клеточных культур, фиксированных в стадии экспоненциального роста. Хемостаты же применяют при скоростях разбавления от самой низкой до только приближающейся к максимальной удельной скорости роста.
В настоящее время разработаны различные варианты непрерывного культивирования микроорганизмов, работающие по принципу турбидостата – pH-стат, оксистат, СО2-стат, теплостат, респиростат, вискозистат и т. д., названия которых соответствуют задаваемому параметру. Любой параметр, который изменяется в периодической культуре и на который существует датчик, может быть использован для управления ростом по типу турбидостата.
|
|
|
Управляющими параметрами могут быть комплексные параметры, например, содержание кислорода и углекислоты в отходящем воздухе, характеризующие дыхательный коэффициент.
Респиростат
Способ управления основан на использовании в качестве датчиков газоанализаторов кислорода или углекислого газа, измеряющих интенствность дыхания культуры. Эта величина пропорциональна росту, образованию продукта и поддержанию жизнедеятельности клеток, т.е. пропорциональна концентрации биомассы. Поэтому, регулируя интенсивность дыхания можно регулировать и концентрацию биомассы, а следовательно, скорость подачи субстрата (D). В респиростате задается определенная величина интенсивности дыхания, близкая к максимальной. В зависимости от этого при снижении интенсивности дыхания величину скорости разбавления повышают, и наоборот. Еще лучше не поддерживать дыхание на постоянном уровне, а все время искать скорость разбавления, обеспечивающую его максимум. Этот алгоритм управления легко реализуется с помощью современных систем управления процессами культивирования.
Оксистат
В этом способе управления подачу питательной среды в аппарат (скорость разбавления) осуществляют таким образом, чтобы поддерживать в среде постоянное, относительно малое значение концентрации растворенного кислорода, поскольку при минимальной концентрации растворенного кислорода достигается максимальная величина его потребления клетками микроорганизмов. Поддержанием потребления кислорода на минимально возможном уровне обеспечивается максимизация производительности процесса.
При этом не следует забывать, что, как всякий субстрат, растворенный кислород влияет на скорость роста биомассы и через нее на скорость потребления кислорода (интенсивность дыхания). Форма этой зависимости такова, что при возрастании концентрации кислорода скорость роста биомассы сначала увеличивается очень быстро, но выше некоторой величины, обозначаемой как «критическая» концентрация растворенного кислорода, скорость роста и скорость потребления кислорода уже практически не зависят от его концентрации. Поэтому в таком способе управления процессом культивирования концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне, близком к «критической» концентрации, за счет изменения скорости подачи свежей среды в аппарат (а не изменяя режимные параметры аэрации и перемешивания).
|
|
|
рН-стат. Активный рост микроорганизмов часто сопровождается закислением культуральной среды, в то время как замедление роста при недостатке субстрата вызывает защелачивание. Следовательно, величина рН может использоваться как параметр, в зависимости от которого в аппарат подается питательная среда. Скорость подачи регулируется таким образом, чтобы величина рН поддерживалась на некотором постоянном уровне. При этом исключают регулирование рН подачей в аппарат щелочи или кислоты.
Нутристат. В этом способе управления подача питательной среды в аппарат осуществляется так, чтобы поддерживать заданное значение концентрации субстрата на постоянном уровне для обеспечения максимальной скорости роста. Этот способ имеет неудобство: необходимо непрерывно измерять концентрацию субстрата в аппарате, что не всегда просто.
Теплостат
В обычных условиях культивирования температуру поддерживают на уровне оптимальной. Как правило, это обеспечивается путем регулирования подачи охлажденной воды в рубашку или змеевик аппарата. Когда при увеличении теплового потока повышается температура, регулятор увеличивает скорость подачи охлаждающей воды. При этом также увеличивается и скорость теплоотвода, что позволяет сохранять равновесие. В теплостате температура устанавливается самопроизвольно на уровне, при котором скорость биологического тепловыделения равна скорости отвода тепла в окружающую среду. Данный уровень обычно выше оптимального, что может замедлять процесс ферментации, хотя и обеспечивает его постоянную скорость. Способ управления широкого применения не имеет. Может быть использован, если по определенным причинам некий ценный целевой продукт выделяется при повышенных температурах.
В промышленности одностадийные хемостатные процессы ферментации применяется для получения микробной массы или тех продуктов, кинетика накопления которых повторяет кинетику роста биомассы.
Применение многостадийных систем позволяет получать культуру при любой скорости роста – от лаг-фазы до экспоненциальной и стационарной. Многостадийные системы обычно используются для получения вторичных продуктов микробного синтеза, кинетика накопления которых в той или иной степени отстает от кинетики роста биомассы.
Многостадийное культивирование с успехом применяется при получении органических кислот, этилового спирта и т. д. Батарея ферментеров применяется также для переработки высоких концентраций субстрата при получении продуктов как первой, так и второй фазы роста.
|
|
|
