 |
Получение протопластов у грибов
|
|
|
|
Гиаджа первым показал, что пищеварительный сок виноградной улитки способен растворять клеточные стенки дрожжей. Анализ химического состава выявил наличие целого комплекса ферментов: глюканазы, маннаназы, протеазы, липазы, хитиназы, целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы и др.
Первые дрожжевые протопласты под действием улиточного сока Helix pomatia («геликаза») были получены Эдди и Вильямсоном в 1957 году.
При воздействии на клеточную стенку грибов литическими ферментами образуется пора, через которую затем протоплазма выходит в окружающую среду, и в присутствии стабилизатора осмотического давления благодаря поверхностному натяжению мембраны приобретает сферическую форму – образуется протопласт. У дрожжевых клеток пора обычно образуется на одном из полюсов или в экваториальной зоне.
Принято считать, что основную роль при лизисе грибных клеточных стенок играют глюканазы, так как именно глюканы являются одними из главных компонентов клеточных стенок дрожжей. Однако для быстрого и эффективного лизиса сложноорганизованной стенки грибов необходимо также присутствие в литическом комплексе и других гидролаз. При совместном воздействии нескольких ферментов проявляется синергический эффект.
Для получения грибных протопластов широко и успешно применяется литический комплекс Streptomyces spp. и некоторые другие.
Для ферментативного лизиса клеточных стенок применяют или культуральную жидкость после инкубирования микроорганизма, или очищенный ферментный препарат. Перед употреблением в смесь ферментов вносят стабилизатор осмотического давления и стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр. Процесс растворения клеточных стенок под действием литического комплекса может продолжаться от нескольких часов до 2 суток.
|
|
|
На образование протопластов, особенно у грибов, значительно влияет возраст культуры. Поэтому рекомендуется использовать молодые дрожжевые клетки и мицелий. Причем, различная возрастная чувствительность грибных клеток к действию литических ферментов объясняется скорее количественными изменениями в клеточной стенке, чем качественными,
Для облегчения процесса получения грибных протопластов можно использовать воздействие редуцирующих веществ (меркаптоэтанола, дитиотреитола, цистеина-HCl, сульфида натрия). Хотя механизм их действия на клетки полностью не выяснен, предполагается, что эти соединения разрывают дисульфидные связи в поверхностном маннан-протеиновом слое, облегчая этим доступность глюкановой матрицы действию литических ферментов.
Лизис грибных клеточных стенок может быть облегчен также обработкой клеток хелатирующими соединениями (Na-ЭДТА) или применением таких приемов, как замораживание-оттаивание.
Лучшими стабилизаторами осмотического давления для грибных протопластов оказались 1 М раствор хлористого натрия и смесь 1 М раствора хлористого натрия с 1 М раствором маннита в соотношении 1:1.
Получение стабильных и жизнеспособных протопластов у двух штаммов Acremonium chrysogenum, отличающихся уровнем антибиотикообразования
Регенерация клеточной стенки и реверсия
К клеточным формам
Реверсии протопластов бактерий и грибов характеризуется определенным сходством. При этом условно можно выделить на три этапа:
1) регенерация клеточной стенки,
2) реверсия, появление клеток-ревертантов,
3) восстановление нормального цитокинеза и появление клеток исходной формы.
Вместе с тем каждой группе микроорганизмов присущи свои особенности протекания реверсии протопластов, связанные со строением клеток и клеточных стенок, характером метаболизма и цитокинеза.
|
|
|
Очень важным фактором, влияющим на реверсию протопластов, является плотность окружающей среды. Жидкие среды для регенерации практически не применяются, поскольку для эффективной регенерации клеточной стенки, очевидно, необходим контакт цитоплазматической мембраны с каким-либо поддерживающим каркасом.
Реверсия протопластов спорообразующих бактерий происходит гораздо лучше на средах, содержащих 2% агара, чем на средах с 0,7 – 0,8% агара. Значительно повышает частоту регенерации применение двухслойного метода. Протопласты ресуспендируют в мягком (0,4 – 0,7%) агаре или легкоплавкой агарозе и помещают на твердую агаризованную среду (1,5 – 2% агара). Эффективность и скорость реверсии протопластов существенно повышается, если их высевать не на свежеприготовленные, а на частично (на 10 – 20%) дегидратированные чашки.
Твердой или полутвердой основой также может быть желатина (5-30%), мембранные фильтры, убитые бактериальные клетки или клеточные стенки.
Кроме того, эффективность реверсии зависит от присутствия аминокислот, витаминов и микроэлементов. Вместе с тем, на очень богатых средах уровень реверсии снижается, вероятно, в связи с несбалансированностью процессов роста протопластов и синтеза компонентов клеточной стенки.
Протопласты очень чувствительны к повышенной температуре, и поэтому даже кратковременное ее воздействие резко снижает эффективность реверсии.
Варьируя соответствующие параметры, можно подобрать условия для реверсии протопластов самых разных видов микроорганизмов. Однако только определив условия, обеспечивающие удовлетворительную реверсию протопластов (обычно, не ниже 0,1%) к клеточной форме, можно приступать к их слиянию.
Слияние протопластов стало возможным после того, как было обнаружено, что эффективным индуктором процесса является ПЭГ —(Као, Mихайлюк, 1974). Поверхность клеток и протопластов заряжена отрицательно и окружена водным слоем. Эти факторы препятствуют контакту и слиянию мембран. Действие ПЭГ сводится к тому, что он, по-видимому, снижает поверхностный заряд протопластов и дегидратирует клетки. Тем самым создаются условия для тесного контакта и слипания мембран. В местах слипания происходит разрыв мембран и содержимое двух соседних протопластов объединяется. Образующиеся структуры сохраняют способность к восстановлению клеточной стенки. В результате появляются гибридные клетки.
|
|
|
ПЭГ чаще всего применяют в концентрации 30 – 50% (масса/объем). При этих концентрациях осмотические стабилизаторы можно не использовать, поскольку эту функцию выполняет сам ПЭГ.
Ионы кальция повышают частоту слияния протопластов, и при pH 7,5 оптимальная их концентрация составляет 10 мМ.
Ионы марганца обычно ингибируют слияние.
Слияние протопластов идет уже при 4°С, и эффективность его увеличивается при повышении температуры до 30°С. В этих условиях для успешного завершения процесса достаточно 2 – 5 мин инкубации с ПЭГ.
Для слияния протопластов берут генетически маркированные штаммы микроорганизмов, часто несущие мутации ауксотрофности и устойчивости к антибиотикам. Перед обработкой ПЭГ суспензии протопластов исходных (родительских) штаммов смешивают и осаждают центрифугированием, что повышает частоту слияния. Затем смесь ресуспендируют и высевают на гипертонические среды.
Продукты слияния протопластов называются фузантами (от англ. fusion — слияние).
При прямой селекции фузанты отбирают сразу на селективных гипертонических средах, где не могут ревертировать протопласты родительских штаммов.
При непрямой селекции смесь протопластов, обработанную ПЭГ, высевают на неселективную гипертоническую среду, а для отбора фузантов выросшие колонии переносятся на селективные среды, не содержащие осмотического стабилизатора.
Специфика отбора рекомбинантов, возникающих при слиянии протопластов, состоит в том, что необходимо создать подходящие условия не только для их селекции, но и для реверсии их к клеточной форме. Часто эти два процесса не могут эффективно осуществляться на минимальных средах. Поэтому чаще используется непрямой метод селекции фузантов.
В слиянии может участвовать более двух протопластов разных штаммов, и в результате сразу появляются рекомбинанты, наследующие признаки трех (и более) родителей. Образующиеся диплоидные, полиплоидные формы и гетерокарионы (у грибов) обычно не стабильны и в неселективных условиях выщепляют гаплоидные рекомбинанты и исходные родительские формы.
Потомство первичных колоний, образовавшихся на селективной среде после слияния протопластов, может состоять из следующих классов:
1) колоний, дающих смешанную популяцию нестабильных форм;
2) колоний, дающих смешанную популяцию стабильных форм;
3) колоний, дающих однородное и стабильное потомство.
|
|
|
