Культивирование растительных протопластов

Для культивирования протопластов возможно использовать метод жидких капель (Као К. и др., 1971). В этом случае суспензия протопластов в виде капель в жидкой среде помещается в пластиковые чашки Петри. Метод обеспечивает хороший газообмен через воздушную фазу и диффузию в раствор экскретируемых продуктов. Кроме того, легко можно добавлять свежий раствор в нужной концентрации.

Однако при культивировании этим способом протопласты агрегируются в центре каждой капли. Накапливаясь, они образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений, что препятствует дальнейшему успешному культивированию. Этот метод также не удобен, если требуется исследовать развитие индивидуальной колонии протопластов.

Удобным вариантом метода жидких капель является культивирование в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов (микроизоляция) предложенное Ю. Глебой в 1978 г. В микрокаплях, даже если в них находится только одна клетка, соотношение объема клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре плотностью около 1000 кл/мл.

Другой широко распространенный метод – агаровая культура или метод платирования (Нагата T., Такебе И., 1971). В этом случае определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде вносят в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же самой среды, содержащей 1% агар-агара. Температура не должна превышать 45 оС. Чашки заклеивают парафиллюмом и культивируют при температуре около 28 оС.

Протопласты фиксированы в одном положении и физически отдалены один от другого. Этот метод имеет важное преимущество: можно наблюдать для одного конкретного протопласта все этапы его развития – формирование клеточной стенки, деление клеток, рост и развитие растения. Недостаток этого метода заключается в том, что возможно некоторое повреждение протопластов при смешивании с теплым агаром.

Одним из вариантов данной методики является использование «кормящих клеток» или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или гамма-излучения (выбирается такая доза облучения, чтобы клетки утратили способность к клеточному делению, но поддерживали и стимулировали рост других клеток). Они смешиваются с жизнеспособными протопластами и платируются.

Можно пласты «кормящих клеток» располагать в нижнем слое, а жизнеспособные протопласты – в верхнем. Этот метод позволяет культивировать суспензию протопластов более низкой концентрации, чем та, что обычно необходима для их роста.

Сходным с этим методом является метод совместных культур (D. Evans, 1979). Метод используется для эффективного культивирования трудно культивируемых протопластов. Такие протопласты культивируются совместно с протопластами, отличающимися быстрым ростом. Успех такого культивирования основан на активных веществах, которые выделяются быстро растущими видами.

По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды подобны таковым для клеточных культур. Наиболее часто используют среды Мурасиге-Скуга, модифицированную среду Нагата-Такебе, среду В5 Гамборга-Эвелейта, и среду 8Р Као-Мичайлук, представляющую собой обогащенную витаминами, аминокислотами и сахарами среду В5 Гамборга. Все эти среды содержат минеральные вещества, являющиеся источниками макро- и микроэлементов, источники углерода, стабилизаторы осмотического давления, витамины, фитогормоны.

Температура культивирования является в значительной степени видоспецифичной и варьирует в достаточно широких пределах. При культивировании растительных протопластов температурный режим должен строго выдерживаться, т. к. обычно протопласты чувствительны даже к незначительным отклонениям от оптимальной температуры. То же касается и интенсивности освещенности. Оптимальные значения освещенности могут варьировать от абсолютной темноты до яркого света.

Существенным фактором культивирования является плотность засева протопластов. При очень низкой плотности протопласты часто не делятся, в то время как при очень высокой плотности возникают затруднения на поздних этапах культивирования из-за появления в ростовой среде токсичных продуктов обмена. Оптимальная плотность протопластов в культуре составляет 103-105 кл/мл.

Практически сразу после удаления раствора фермента может начинаться образование клеточной стенки. Для стимулирования образования клеточной стенки рекомендуется добавлять в среду сахара, входящие в состав клеточной стенки, а также ксилозу, рибозу и другие. Состав этих добавок может быть очень специфичным в зависимости от видовых особенностей протопластов.

Для индукции деления протопластов многих видов растений эффективно добавлять в среду ауксины – 2,4-Д, НУК, а также цитокинины – кинетин, зеатин, бензиладенин.

Труднее добиться регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого также добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.

Р. Г. Бутенко (1979—1981) выделил следующие факторы, которые определяют пролиферативную способность клеток, возникших из изолированных протопластов:

Видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растений.

Способ и условия выделения протопластов.

Плотность высева протопластов.

Состав питательной среды, причем это относится не только к гормональным и витаминным добавкам, но и к. концентрации минеральных солей и рН.

Таким образом, используя разнообразные методы, учитывая характерные особенности исходного материала и соблюдая все условия, возможно успешное осуществление культивирования растительных протопластов, добиваясь в отдельных случаях получения целого растения из единичных протопластов. Впервые Т. Нагата и И. Такебе осуществили регенерацию целых растений табака из протопластов мезофилла листа (Nicotiana tabacum).

Детальная разработка техники культивирования растительных клеток и получения и культивирования растительных протопластов послужила основой для создания методов биотехнологического конструирования растений с заданными свойствами.