 |
Определение антимикробной активности антибиотиков. Условия ферментации антибиотиков. Рост биомассы АБ. Предшественники АБ.
|
|
|
|
Культуры растительных клеток и получение лекарственных веществ. Методы контроля и идентификации (цитофизиологические, химические, биохимические, биологические) биомассы и препаратов. Лекарственные препараты, получаемые из культур клеток женьшеня, родиолы розовой,воробейника, стевии, наперстянки, табака.
Культура растительных клеток как источник лекарственных веществ
Природные запасы лекарственных растений уменьшаются, а синтез БАВ либо не осуществлен, либо нерентабелен. Поэтому технология получения биомассы на основе культуры клеток приобретает большое значение для производства лекарственных средств.
Преимущества использования клеточных культур заключаются в следующем:
-решается проблема дефицита исходного сырья, особенно ценных исчезающих видов, не поддающихся плантационному культивированию;
-возможно получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, пестицидов, тяжелых металлов и др.; имеется возможность получения новых веществ, не синтезируемых соответствующим целевым растением; возможно управление биосинтезом целевых продуктов за счет условий культивирования, состава питательной среды и другими способами;
-имеется возможность индустриализации и удешевления производства некоторых БАВ, синтез которых пока не разработан или очень дорог.
Вместе с тем, развитие производства БАВ из изолированных клеточных культур в промышленных масштабах сдерживается рядом причин. Некоторые культуры изолированных клеток и тканей либо не синтезируют БАВ, характерные для соответствующего целого растения, либо вырабатывают их значительно меньше. В сравнении с микроорганизмами растительные клетки растут значительно медленнее, время их удвоения в среднем в 20 раз больше, чем клеток микроорганизмов. Вследствие длительности производства высок риск инфекций и гибели культур. Кроме того, большие объемы суспензионных культур растительных клеток состоят как из единичных клеток, так и агрегатов различного размера, которые не идентичны, что усложняет процесс производства БАВ. Вторичные метаболиты многих растительных культур не выделяются в питательную среду, что создает трудности их экстрагирования. Из-за больших размеров растительные клетки очень чувствительны к перемешиванию и снабжению кислородом. Себестоимость производства лекарственных средств на основе культуры изолированных растительных клеток достаточно высока. Промышленный выпуск такой продукции рентабелен лишь для особо ценных БАВ.
|
|
|
В настоящее время получено более 30 видов различных изолированных клеточных культур лекарственных растений, продуцирующих БАВ либо на уровне соответствующего интактного растения, либо в большем количестве.
Первый отечественный биопродукт из культуры изолированных клеток — настойка «Биоженьшень». Препарат получен на основе высокопродуктивного клеточного штамма культуры клеток женьшеня и используется для изготовления лосьонов, кремов, а также тонизирующих напитков. Комплекс гинзенозидов (сапонинов женьшеня), выделяемый из культуры тканей, предлагается в качестве противоэпилептического средства.
Культивируемые in vitro клетки раувольфии змеиной являются перспективным источником гипотензивных и противоаритмических индольных алкалоидов. Методами клеточной селекции с использованием химических мутагенов и оптимизации условий выращивания получен высокопродуктивный штамм, накапливающий противоаритмический алкалоид аймалин, содержание которого составляет около 50% от суммы алкалоидов, синтезируемых культурой.
|
|
|
Получены изолированные клеточные культуры из различных видов барбариса, а также василисника малого. Суспензионная клеточная культура василисника малого продуцирует берберин - растительный антибиотик и противоопухолевое средство, при этом более 80% синтезируемых тканями алкалоидов секретируются в культуральную жидкость. В Японии налажено биотехнологическое производство противоопухолевого алкалоида берберина из культуры клеток коптиса японского, а также производство нафтохинонового пигмента шиконина - природного антибиотика широкого спектра действия из культуры клеток Воробейника. На основе шиконина российские ученые разработали мазь «Эритромин», которая обладает антимикробной активностью в отношении антибиотико-резистентных микроорганизмов, многих патогенных бактерий, а также грибов.
2.Антибиотики как биологические продукты. Методы скрининга продуцентов. Происхождение антибиотиков и эволюция их функций. Причины позднего накопления антибиотиков в ферментативной среде по сравнению с накоплением биомассы.
Это средство преодоления стрессовых ситуаций для м/о. Для почвенных м/о антибиотики не только средство борьбы, но и низкомолекулярные эффекторы. С помощью антибиотиков м/о меняют метаболизм при неблагоприятных условиях.
Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности различных групп м/о низших и и высших растений и живых или их модификаций, обладающие повышенной физиологической активностью в отношении определенных групп м/о или злокачественных опухолей, избирательно задерживают рост или подавляют развитие.
Возникновение антибиотиков.
1.при происхождении жизни на земле АБ являлись стимуляторами или ингибиторами процесса матричного синтеза. При возникновении рибосом появились другие регуляторы, т.о. АБ вытеснились и сохранились у некоторых организмов, у которых они сохранившись превратились из стимуляторов синтеза белка в ингибиторы.
2.АБ – случайные продукты м/о. плазмида циркулирует по микробным популяциям. При передаче плазмиды другим м/о в результате рекомбинаций и мутаций могут синтезировать случайные вещества, из которых образ. АБ
АБ являются веществами, коотрые вырабатываются одним м/о и подавляют рост другого м/о или опухолевых клеток.
|
|
|
Полусинтетические АБ – это природные АБ, модифицированные ферментами или химическим путем.
Беталактамные антибиотики. Продуценты беталактамных АБ. Особенности строения клетки и цикла развития при ферментации. Роль фенилуксусной кислоты при биосинтезе пенициллина. Сборка углеродного скелета.
- пенициллины
-цефалоспорины.
На основе chrysogenum получены полусинтетичесие антибиотики из
пенициллина – полусинтетические пенициллины: оксациллин,
карбенициллин; из цефалоспорина С – цефалоспорины I,II, III, IY
поколения.
Первичные метаболиты (предшественники) b-лектамных антибиотиков -
три
аминокислоты: цистеин, валин, аминоадипиновая кислота.
Продуцентами пенициллинов и цефалоспоринов являются грибы.
Penicillum chrysogenum (пенициллины)
Acremonium chrysogenum (цефалоспорины).
Грибы – это организмы, которые имеют ядра, митохондрии, клеточную
стенку, содержащую хитин, имеют сложный цикл развития. Помимо
антибиотиков грибы используют для получения иммунодепрессанта –
циклоспорина (продуцент – Tolypocladium inflatum), фузидина – антибиотика,
в основе которого лежит стероидное ядро сердечных гликозидов (продуцент –
гриб Fusidium coccineum).
Дрожжи являются продуцентами витаминов и ферментов.
Механизм действия) b-лектамных антибиотиков. Они ингибируют синтез
пептидогликана клеточной стенки на последнем этапе, подавляя активность фермента транспептидазы. Транспептидазы соединяют концы пептидных
цепочек, на концах которых находится D-аланин, а b-лектамные
антибиотики являются аналогами D-аланина и связываются с активным
центром фермента, тем самым инактивируя его. В результате пептидные
цепочки не замыкаются.
Актиномицеты – это многоклеточные бактерии. Актиномицеты не имеют
ядра (вместо ядра имеется одна замкнутая нить ДНК), т.е. актиномицеты –
прокариоты, не имеют митохондрий, имеют сложный цикл развития.
Актиномицеты продуцируют следующие группы
антибиотиков:
Аминогликозиды – ингибируют синтез белка у бактерий, связываясь с малой
|
|
|
рибосомной субъединицей, нарушая правильность считывания кодонов
информационной РНК (иРНК) антикодонами транспортной РНК (тРНК).
-канамицин - Actinomyces kanamycetus
-неомицин - Actinomyces iracie.
Тетрациклины ингибируют белковый синтез, связывая аминоацил –тРНК с
рибосомно-матричным комплексом,
-окситетрациклин – Аctinomyces ninesus/
макролиды гр. эритромицина – связываются с большой субъединицей
рибосомы.
пиранозиды (группы линкомицина – сходны с макролидами, они связываются
с большой субъединицей рибосомы.
- линкомицин – Streptomyces linconiensis/
левомицетин (получают химическим путем) – ингибирует пептилтрансферазу
большой рибосомальной субъединицы.
Природный левомицетин (хлорамфеникол) продуцируется Streptomyces
venezuelae.
Рифамицин – Streptomyces mediterranei, на основе рифамицина получен
рифампицин.
Рифампицин подавляет активность ДНК-зависимую РНК-полимеразу и тем
самым блокирует синтез белка на уровне транскрипции.
противогрибковые - (полиеновые) антибиотики – образуют поры в
цитопластической мембране грибов, взаимодействуя с ее стерольным
компонентом (эргостеролом). (рис.)
- нистатин - Streptomyces noursei
- леворин – Actinomyces levorus
- амфотерцин - Streptomyces nodosus
противоопухолевые антибиотики - угнетают синтез нуклеиновых кислот
клеток микро- и макроорганизмов.
- брунеомицин – Actinomyces albusvar bruneomycini
- митомицин – Streptomyces caespitosus.
Бактерии – также способны к образоыванию антибиотиков. Образуют
антибиотики и большинство бацилл, которые являются спорообразующими
бактериями. В медицине применяют полимиксины, продуцируемые
спорообразующими почвенными бактериями Bacillus polymyxa.
Полимиксины (полимиксин, грамицидин) по химическому строению
являются сложными соединениями, включающими остатки полипептидов.
Они нарушают развитие цитоплазматической мембраны у бактерий,
повышают ее проницаемость.
Условия ферментации.
- в среде не должно быть глюкозы (нельзя использовать легко усвояемые
источники углеводов), используют трудно усвояемые источники углеводов –
например, крахмал.
- в качестве источника аммонийного азота используют соевую муку;
- должна быть небольшая концентрация фосфора.
Любые предшественники для получения антибиотической структуры надо
добавлять не в «0» точке ферментации, а на 2-е, 3-и сутки (если продуцент –
грибы или актиномицеты), когда антибиотики начинают синтезироваться (это
относится, например, и к фенилуксусной кислоте (ФУК) при синтезе
пенициллина, которую добавляют на вторые или третьи сутки биосинтеза
пенициллина).
4. Синтез антибиотиков, образуемых актиномицетами: аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, левомицетин. Сборка углеродного скелета. Фактор А и биосинтез стрептомицина.
|
|
|
Актиномицеты – это многоклеточные бактерии. Актиномицеты не имеют
ядра (вместо ядра имеется одна замкнутая нить ДНК), т.е. актиномицеты –
прокариоты, не имеют митохондрий, имеют сложный цикл развития.
Всего имеется 12 тысяч природных антибиотиков, из них 9 тысяч
антибиотиков продуцируют актиномицеты. Актиномицеты продуцируют
антибиотики, ингибирующие синтез белка на рибосомах бактериальных
клеток. Такой же механизм у противогрибковых и противоопухолевых
антибиотиков. Актиномицеты продуцируют следующие группы
антибиотиков:
Аминогликозиды – ингибируют синтез белка у бактерий, связываясь с малой
рибосомной субъединицей, нарушая правильность считывания кодонов
информационной РНК (иРНК) антикодонами транспортной РНК (тРНК).
-канамицин - Actinomyces kanamycetus
-неомицин - Actinomyces iracie.
Тетрациклины ингибируют белковый синтез, связывая аминоацил –тРНК с
рибосомно-матричным комплексом,
-окситетрациклин – Аctinomyces ninesus/
макролиды гр. эритромицина – связываются с большой субъединицей
рибосомы.
пиранозиды (группы линкомицина – сходны с макролидами, они связываются
с большой субъединицей рибосомы.
- линкомицин – Streptomyces linconiensis/
левомицетин (получают химическим путем) – ингибирует пептилтрансферазу большой рибосомальной субъединицы.
Природный левомицетин (хлорамфеникол) продуцируется Streptomyces
venezuelae.
Рифамицин – Streptomyces mediterranei, на основе рифамицина получен
рифампицин.
Рифампицин подавляет активность ДНК-зависимую РНК-полимеразу и тем
самым блокирует синтез белка на уровне транскрипции.
А-фактор представляет собой 25-изокаприлоил-38-оксиметил-у-бутиролактон. Актиномицет одновременно синтезирует два гомолога.
А-фактор оказывает стимулирующее влияние на биосинтез стрептомицина у недостающих по А-фактору мутантов Str. griseus, а также принимает участие в образовании стрептомицина активными продуцентами этого антибиотика.
Нарушение образования А-фактора оказывает влияние на процессы, связанные с биосинтезом молекулы стрептомицина, — резко уменьшается активность амидинотрансферазы — фермента, участвующего в образовании стрептомицина.
Получен мутант продуцента стрептомицина, блокированный по биосинтезу стрептидина (такие мутанты называют идиотрофами). Образование антибиотика этим мутантом происходит лишь в том случае, если к среде добавлен стрептидин. С увеличением добавленного стрептидина синтез стрептомицина возрастает. Это указывает на то, что стрептидин целиком включается в молекулу стрептомицина, т. е. является ее предшественником.
Образование стрептомицина на 5-е сут, мкг/мл
В культуральной жидкости актиномицета, развивающегося без А-фактора, образуется другое вещество регуляторного характера, способное индуцировать переход развития актиномицета в стадию активного образования стрептомицина. Получен ряд мутантов Str. griseus с блоками биосинтеза стрептидина на разных этапах. Выделены мутанты продуцента стрептомицина, блокированные по биосинтезу стрептобиозамина. Добавление стрептобиозамина в среду, где развиваются полученные мутанты, способствовало увеличению образования стрептомицина в 3—6 раз. Использование стрептобиозамина происходит на относительно поздних стадиях развития актиномицета. Аналогичные приемы, широко применяемые при изучении процессов биосинтеза антибиотиков, получили название мутосинтез или мутационный синтез.
Приведенные результаты показывают, что в процессе образования стрептомицина участвует ряд регуляторных механизмов, выявление которых с помощью мутантных штаммов актиномицета поможет вскрыть истинные пути механизма биосинтеза молекулы стрептомицина.
Промышленное получение стрептомицина
Производство стрептомицина в настоящее время исчисляется тоннами. Увеличение производства антибиотика осуществлялось не только за счет расширения и увеличения числа промышленных предприятий, но и за счет, в основном, следующих трех мероприятий: 1) получение наиболее активных штаммов актиномицета — продуцента стрептомицина; 2) подбор наиболее благоприятных сред и других условий культивирования продуцента, обеспечивающих максимальный биосинтез стрептомицина, 3) разработка наиболее рациональных методов выделения и очистки антибиотика.
5. Противогрибковые (полиеновые антибиотики). Противоопухолевые антибиотики. Механизм действия. Ферментативная внутриклеточная активации некоторых противоопухолевых антибиотиков.
Противогрибковые - (полиеновые) антибиотики – образуют поры в
цитопластической мембране грибов, взаимодействуя с ее стерольным
компонентом (эргостеролом).
- нистатин - Streptomyces noursei
- леворин – Actinomyces levorus
- амфотерцин - Streptomyces nodosus
В медицине применяют полимексины продуцированные спорообразующими почвенными бактериями Bacillus polymyxa.
По химическому строению явл сл соединениями включающие остатки полипептидов. Нарушают развитие цитоплазмотической мембраны у бактерий, повышают проницаемость.
противоопухолевые антибиотики - угнетают синтез нуклеиновых кислот
клеток микро- и макроорганизмов.
- брунеомицин – Actinomyces albusvar bruneomycini
- митомицин – Streptomyces caespitosus.
Определение антимикробной активности антибиотиков. Условия ферментации антибиотиков. Рост биомассы АБ. Предшественники АБ.
Антибиотики — химиотерапевтические средства, образуемые микроорганизмами или получаемые из других природных источников, а также их производные и синтетические продукты, обладающие способностью избирательно подавлять в организме больного возбудителей заболевания. Антибактериальные препараты (АБП) отличаются от всех других лекарственных средств тем, что они в первую очередь действуют не на организм больного, а на болезнетворный агент.
Определение антимикробной активности АБ.
Определение антимикробной активности антибиотиков основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест - микробов,образующихся при испытании растворов определенных концентраций.Государственного стандартного образца <*> и испытуемого препарата.Антимикробная активность антибиотиков выражается в единицах действия - ЕД или "мгк". Для большинства антибиотиков 1 ЕД или "мкг" соответствуют 1 мкг активного вещества (кислоты или основания); для антибиотиков, имеющих иное количественное выражение единицы, соответствующие указания даются в частных статьях. При определении антимикробной активности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило,устанавливают в соответствии с Международными биологическим стандартами. При отсутствии последних для указанных целей могут быть использованы международные химические стандарты, антимикробную активность которых рассчитывают на основании показателей качества, установленных физико - химическими методами.Антимикробную активность стандартных образцов антибиотиков, не имеющих аналогов в международной коллекции стандартов,рассчитывают также на основании показателей качества,установленных физико - химическими методами.Метод определения. Тест - микробы, растворители, буферные растворы, питательные среды и прочие условия проведения испытания Указаны. В чашки Петри (стеклянные или пластмассовые), установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью, разливают расплавленные питательные среды определенного состава в один или два слоя. Для нижнего слоя используют незасеянные среды, для верхнего или одного слоя - агаровую среду, предварительно засеянную соответствующим тест - микробом.Шесть стерильных цилиндров единого размера и массы, высотой (10,0 +/-0,1) мм и внутренним диаметром (6,0 +/-0,1) мм, из нержавеющей стали или алюминия расставляют на поверхности засеянной среды на равном расстоянии друг от друга и от края чашки.В цилиндры или лунки каждой чашки вносят равные объемы рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов.Диаметры зон угнетения роста тест - микроба при помощи соответствующих приборов измеряют с точностью до 0,1 мм.
Определение антимикробной активности антибиотиков с использованием трехдозного варианта метода диффузии в агар. Для проведения испытания готовят три раствора стандартного образца(C1, С2, С3) и три раствора испытуемого образца (И1, И2, И3).Все растворы стандартного и испытуемого образцов вносят в цилиндры или лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы растворы с большими концентрациями не соприкасались между собой.Расчет активности и дисперсионный анализ при использовании трехдозного варианта метода диффузии в агар осуществляется в соответствии со статьей "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний".
Определение антимикробной активности антибиотиков с использованием стандартной кривой. Постановка опыта. В день постановки анализа из основного раствора готовят пять рабочих растворов стандартного образца C1, С2, С3, С4, C5 с концентрациями, увеличивающимися в геометрической прогрессии (Z), обычно в соотношении 1:1,25. Средняя концентрация (С3) является контрольной. Раствор контрольной концентрации С3 закапывают в три цилиндра (или лунки) каждой из взятых в опыт чашек, в три другие цилиндра (лунки) закапывают раствор одной из концентраций стандартного образца, чередуя его с раствором контрольной концентрации. Таким образом, для построения стандартной кривой используют 12 чашек. После инкубации в термостате измеряют диаметры зон угнетенияроста тест - микробов. Далее вычисляют среднюю величину диаметров зон для раствора контрольной концентрации стандартного образца в каждой группе из трех чашек, затем среднюю величину диаметров зон для раствора контрольной концентрации стандартного образца из всех 12 чашек (общую среднюю из 36 зон). По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, установленной из 12 чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации, установленной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней величине диаметра зоны данной концентрации,если она положительная, и вычитают, если она отрицательная.
Условия ферментацииАБ.
-использование простых или комплексных сред в зависимости от АБ. Среды богаты многокомпонентными питательным веществами.
-в среде не должно быть глюкозы (нельзя использовать легко усвояемые источники углеводов), используют трудно усвояемые источники углеводов –например, крахмал. Не является репрессором биосинтеза и лактоза,которая трудно утилизируется.
- в качестве источника аммонийного азота используют соевую муку;Аммоний и другие легкоутилизируемые источники азотакак и легкоокисляемые углеводы усиливают рост продуцентов АБ,но отрицательно влияют на их биосинтез. Соевая и хлопковая мука,БВК(белково-витаминный концентрат) медленно расщепляются в процессе ферментации,т.е из ни медленно высвобождаются аминокислоты и ионы аммония,это способствует высокому выходу АБ.
- должна быть небольшая концентрация фосфора.Высокое содержание фосфора способствует обогощению клеток макроэргическими фосфорными соединениями,что повышает скорость роста мицелия.Накапливается много биомассы,но мало АБ.
-Кислород необходим для синтеза большинства АБ,тк он расходуется на замыкание беталактамного и тиазолидинового колец во время биосинтеза беталактамнойстуктуры.В целом потребность в кислороде зависит от концентрации биомассы и её метаболической активности. Оптимизация снабжения кислородом достигается увелечением скорости его переноса.
Любые предшественники для получения антибиотической структуры надо
добавлять не в «0» точке ферментации, а на 2-е, 3-и сутки (если продуцент –
грибы или актиномицеты), когда антибиотики начинают синтезироваться (это
относится, например, и к фенилуксусной кислоте (ФУК) при синтезе
пенициллина, которую добавляют на вторые или третьи сутки биосинтеза
пенициллина).
Рост биомассы АБ.
Предшественники АБ.
β-лактамные антибиотики синтезируются из аминокислот L-цистеин, L -валин, L -аминоадипиновая кислота, из которых синтезируется LLD-трипептид (L –валин превращается в D-валин). Из линейного LLD-трипептидаобразуетсялактамное кольцо, затем образуется пятичленное серосодержащеекольцо и т.д. Антибиотики не являются продуктом матричного синтеза.
Аминогликозиды синтезируются из глюкозы.Тетрациклины и макролиды синтезируются с помощью ацетилкоэнзимаА(Ац-КоА) наподобие жирных кислот (с участием приблизительно 22-х
ферментов).Ферменты синтезирующие антибиотики образуют мультиферментные
комплексы (за счет водородных связей), в которые «входят»предшественники антибиотика, а «выходит» целая молекула антибиотика (вовнешнюю среду). Эти комплексы располагаются по периферии клеткипродуцента. Таким образом, антибиотики отделяются от других систем
синтеза в клетке, и антибиотик никак не воздействует насвой продуцент (не ингибирует и не активирует другие процессы). К тому же мембраныпродуцента непроницаемы для вышедшего продуцента, тем самым создаваяусловия одностороннего движения антибиотика только во внешнюю среду.
7. Механизмы защиты продуцентов от антибиотиков. Ретроингибирование антибиотиков. Механизмы развития резистентности у бактерий к антибиотикам. Антибиотики резерва (ванкомицин, тейкопламин, ристомицин). Антибиотики с ингибиторами беталактамаз микроорганизмов. Пенициллинсвязывающие белки (ПБС-2, ПБС-3).
Механизмы защиты продуцентов от антибиотиков.
Ретроингибирование – это ингибирование синтеза по механизму обратной связи.
Очень важно бороться с ретроингибированием.
|
|
|
