Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Совершенствование методов двухмерного электрофареза и визуализация протеома в каждый данный момент




Метод двумерного гель-электрофореза, в котором объединены две различные процедуры разделения, позволяет идентифицировать более 1000 белков. Результаты при этом получают в виде «двумерной» белковой карты. При работе данным методом на первом этапе белки разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой объем раствора, содержащего неионный (незаряженный) детергент - меркаптоэтанол, и в качестве денатурирующего агента - мочевину. В этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация всех без исключения полипептидных цепей; при этом изменения заряда цепей не происходит. Диссоциированные полипептидные цепи разделяют. Каждый из белков может быть охарактеризован изоэлектрической точкой. ри изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в узкой трубочке, заполненной полиакриламидным гелем, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней. Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гель-электрофореза. На втором этапе трубочка геля, содержащего разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигрирует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Так осуществляется разделение во втором направлении двумерного гель-электрофореза.

Техника двумерного электрофореза требует, однако, в ряде случаев усовершенствования. Например, ведется поиск особых приемов для улучшения идентификации гидрофобных (связанных с мембранными структурами) белков.

Актуальным является уменьшение трудоемкости анализа совокупности белков микробной клетки, поскольку в ней насчитывается несколько тысяч индивидуальных белков. Тем не менее уже достигнута идентификация в одном эксперименте около 2000 белков.

Количественная протеомика.

количественная протеомика, позволяющая количественно сопоставлять экспрессию отдельных белков.

20.Определение экологии. Вклад биотехнологии в решении общих экологических проблем. Замена традиционных производств. Сохранение природных ресурсов источников биологического сырья. Разработка новых высокоспецефичных методов анализа. Биосенсоры. Классификация феромонов. Сигнально-комуникативные молекулы фермоны: феромоны-ремизеры, феромоны- праймеры.

Определение экологии

Экология – наука об отношении организмов к окружающей среде

Биосенсоры - это аналитические устройства, использующие биологические материалы для "узнавания" определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. Большинство биосенсоров ориентированы на анализ биологических жидкостей. Действительно, например, в крови находятся тысячи различных соединений. Задача заключается в том, чтобы быстро и эффективно (количественно) определить концентрацию нужного соединения, например глюкозы. Для людей, страдающих диабетом, это жизненно важный клинический анализ. Биосенсоры обеспечивают такую возможность/

Классификация феромонов

1. по взаимодействию между видами животных

а) анеомоны- дает выгоду донору

б) кайромоны- дает выгоду реципиенту

2. по практическому использованию феромонов

А) феромоны-ловушки

Б) феромоны- микроорганизмы

Сигнально-комуникативные молекулы фермоны: феромоны-ремизеры, феромоны- праймеры.

По своему воздействию феромоны делятся на два основных типа: релизеры и праймеры.

Релизеры — тип феромонов, побуждающих особь к каким-либо немедленным действиям и используются для привлечения брачных партнёров, сигналов об опасности и побуждения других немедленных действий.

Праймеры используются для формирования некоторого определённого поведения и влияния на развитие особей: например, специальный феромон, выделяемый пчелой-маткой. Это вещество подавляет половое развитие других пчёл-самок, таким образом превращая их в рабочих пчёл.

Вклад биотехнологии в решении общих экологических проблем.

Биотехнологические процессы с использованием микроорганизмов и ферментов уже на современном техническом уровне широко применяются в пищевой промышленности. Промышленное выращивание микроорганизмов, растительных и животных клеток используют для получения многих ценных соединений - ферментов, гормонов, аминокислот, витаминов, антибиотиков, метанола, органических кислот (уксусной, лимонной, молочной) и т. д. С помощью микроорганизмов проводят биотрансформацию одних органических соединений в другие (например, сорбита во фруктозу). Широкое применение в различных производствах получили иммобилизованные ферменты. Для выделения биологически активных веществ из сложных смесей используют моноклональные антитела.

А.С. Спириным в 1985-1988 разработаны принципы бесклеточного синтеза белка, когда вместо клеток применяются специальные биореакторы, содержащие необходимый набор очищенных клеточных компонентов. Этот метод позволяет получать разные типы белков и может быть эффективным в производстве. Многие промышленных технологий заменяются технологиями, использующими ферменты и микроорганизмы. Такие биотехнологические методы переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов, очистки и использования сточных вод для получения биогаза и удобрений. В ряде стран с помощью микроорганизмов получают этиловый спирт, используют как горючее для автомобилей (в Бразилии, где топливный спирт широко применяется, его получают из сахарного тростника и других растений). На способности различных бактерий переводить металлы в растворимые соединения или накапливать их в себе основан извлечение многих металлов из бедных руд или сточных вод.

21. Иммуноглобулины (ИГ). Основные этапы получения нормальных иммуноглобулинов человека (γ-глобулинов).

Природа антител. В ответ на введение антигена иммунная система вырабатывает антитела – белки, способные специфически соединяться с антигеном и т. о. участвовать в иммунологическом ответе. Они относятся к γ-глобулинам, т. е. наименее подвижной фракции белков. Вырабатываются плазмоцитами. Кол-во γ-глобулинов примерно 30% от всех белков плазмы.

Антитела – ИГ, которые вырабатываются в ответ на введение антигена и способные специфически взаимодействовать с ним.

Функции антител.

1. Первичная – взаимодействие активных центров антител с комплементарными детерминантами антигенов.

2. Вторичная – способность: а) связывать антиген с целью его нейтрализации и элиминации; б) участвовать в распознавании чужого антигена; в) обеспечивать кооперацию иммунокомпетентных клеток (макрофагов, лимфоцитов); г) участвовать в различных формах иммунного ответа.

Структура антител. Белки ИГ по хим. составу относятся к гликопротеидам и построены из 18 аминокислот. Мол. масса 150 - 900 кД. Молекулы имеют цилиндрическую форму. До 80% ИГ устойчивы к слабым кислотам и щелочам и нагреванию до 600 С. Выделить из сыворотки можно физ. (электрофорез, аффинная хроматография) и хим. (изоэлектрическое осаждение спиртом, кислотами, высаливание). ИГ по структуре, антигенным и иммунологическим св-вам делят на 5 классов: ИГ-М, ИГ-G, ИГ-А, ИГ-Е, ИГ-D. Иг-М, G, А имеют подклассы. Все классы и подклассы различаются по аминокислотной последовательности.

Молекулы ИГ состоят из полипептидных цепей – двух одинаковых тяжелых цепей Н и двух одинаковых легких цепей L, которые соединяются между собой дисульфидными мостиками.

 

Каждому классу подлежат 5 типов тяжелых цепей – μ, γ, α, ε, δ, различающихся по антигенности.

Легкие цепи всех классов общие и бывают двух типов: k и λ.

L-цепи ИГ различных классов могут вступать в соединения как с гомологичными (L), так и с гетерологичными H-цепями. Однако в одной и той же молекуле могут быть идентичные k-цепи.

Как в Н-, так и в L-цепях есть вариабельная чаcть – V, в которой последовательность аминокислот не постоянна, и константная область С с постоянным набором аминокислот. В L- и Н-цепях различают NН2- и СООН-концевые группы.

При обработке γ-глобулин меркаптоэтанолом разрушается дисульфидные связи и молекула ИГ, распадается на отдельные цепи полипептидов.

При воздействии протеолитическим ферментом () ИГ расщепляется на 3 фрагмента некристаллизующихся содержащих детерминантные группы к антигену (называют Fab-фрагментами I и II) и один крмсталлизующийся Fc-фрагмент.

Fab I и Fab II-фрагменты сходны по свойствам аминокислотному составу; Fab- и Fc- фрагменты являются компактными образованными, соединенными между собой гибкими частями H-цепи, поэтому ИГ имеет гибкую структуру.

Как H-, так и L-цепи имеют линейносвязанные компактные участки, называемые доменами. В H-цепи по 4 домена, а в легкой – по 2 домена.

Активные цепи (детерминанты), которые формируются в V-областях, составляют около 2% процента от всей поверхности ИГ.

В каждой молекуле есть 2 активных центра, которые относятся к гипервариабельным участкам тяжелых и легких цепей, т. е. каждая молекула ИГ может связывать по 2 молекулы антигена. Поэтому антитела являются двухвалентными.

ИГ М – 5 структур.

ИГ А может быть мономерными, димерными, тримерными. Бывает сывороточный и секреторный.

Если ИГ А секреторный, то молекула соединена с секреторным компонентом, который выделяется эпитемальными клетками, что защищает ИГ А от разрушения ферментами.

ИГ Е обладает высокой способностью присоединяться к тучным клеткам и базофилам, в результате выделяется гистамин и гистаминоподобные вещества.

ИГ D склонен к агрегации, имеет дополнительные дисульфидные связи.

В ответ на введение любого антигена возможна выработка ИГ всех всех пяти классов. Обычно вначале вырабатывается ИГ М, затем ИГ G, затем остальные. Фракции ИГ: ИГ G – 70 – 80% ИГ A – 10 – 15% ИГ M – 5 – 10% ИГ E – 0,002% ИГ D – 0,2%

Синтез антител. Основные этапы получения нормальных ИГ человека.

1. Плазму крови получают методом плазмофореза: кровь донора собирается в стерильные емкости из полимерного материала, содержащий р-р антикоагулянта (5% р-р цитрата натрия). Кровь центрифугируют, плазма отделяется, клетки возвращаются донору.

2. Выделение γ-глобулиновой части белков крови фракционированием 8-26% этанолом при температуре ниже 00С. В этих условиях денатурирующее действие этанола незначительно и выделяемая γ-глобулиновая фракция сохраняет растворимость.

3. Лиофилизация γ-глобулинов.

4. Приготовлении 10% р-ра γ-глобулина, стерилизация, фильтрация и ампулирование.

5. Контроль на стерильность, апирогенность, содержание белка и безвредность.

Кроме нормальных ИГ из крови лоноров-добровольцев получают специфические ИГ: противостолбнячный, противококлюшевый, противостафилококковый, противовирусные (против гриппа, оспы, бешенства, энцефалита и др.).

Нормофлоры (побиотики, микробиотики, эубиотики) – препараты на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов. Общие проблемы микроэкологии человека. Понятие симбиоза. Различные виды симбиоза. Резидентная микрофлора ЖКТ. Причины дисбактериоза. Нормофлоры в борьбе с дисбактериозом. Гнотобиология. Гнотобионты.

Нормальная микрофлора – совокупность микробиоценнозов различных частей тела, контактирующих с внейней средой. Совокупность микробиоценозов называется нормобиоценоз или эубиоз.

В организме человека проживает 1014-1016 бактерий, которые составляют «экстракорпоральный» орган со своими функциями, критериями, показателями состояния. Биомасса м/о составляет около 2,5-3 кг от веса человека.

Нарушения равновесия между отдельными видами м/о может повлечь нарушения гомеостаза. Дисбиотические состояния приводят к изменению качественного и количественного состояния нормофлоры человека.

М/о можно разделить на 4 группы:

1. М/о, не способные к длительному пребыванию в организме человека, нахождение которых носит случайный характер.

2. Постоянные представители микрофлоры, приносящие пользу (бифидо-, лакто- и колибактерии).

3. Условно-патогенные представители нормофлоры, α при определенных условиях могут стать патогенными (стафилококк).

4. М/о – возбудители инфекционных заболеваний.

 

Симбиоз (от греч. symbiosis «совместная жизнь») — это близкое сообщество живых организмов, принадлежащих к разных видам. Такое сообщество может принимать различные формы в зависимости от природы отношений между двумя видами и от того, полезны эти отношения или вредны. Отношения, полезные для обоих видов, называются мутуализмом. Если отношения полезны для одной стороны и безразличны для второй, они называются комменсализмом, а аменсализмом — отношения, вредные одному организму, но безразличные другому. Отношения, вредные для одной стороны и полезные для другой, называются паразитизмом.

Ведущее место по численности среди микрофлоры кишечника занимают молочнокислые бактерии. Они относятся к грамположительным истинным бактериям.

Нормальная микрофлора кишечника формирует колонизационную устойчивость организма. Один из главных механизмов защиты от колонизации условно патогенными и патогенными м/о - присутствие достаточного кол-ва полезной имикрофлоры. Представители нормофлоры в кишечнике конкурируют с патогенной микрофлорой за аргинин, аспарагиновую кислоту и серин, а также за область обитания.

В процессе жизнедеятельности м/о образуются органические кислоты, которые снижают рН среды толстой кишки до 5,3-5,8, лизоцим и другие антибиотикоподобные вещества. Снижается хроническое отравление организма продуктами гнилостного распада в кишечнике (фенол, индол, скатол).

Бактериальные протеазы гидролизуют белки и пептиды, которые затем распадаются до аминокислот и пептидных остатков. Метаболизируются азот- и углеродсодержащие соединения, мочевина за счет уреаз. Участие в деградации липидов и их синтезе. Нормофлора принимает участие в рециркуляции желчных кислот и влияет на холестериновый и билирубиновый обмен.

Бифидо- и лактобактерии, бактероиды, эубактерии способствуют всасыванию кальция, витамина Д, железа. Эшерихии, бифидо-, лакто- и эубактерии выполняют витаминообразующую функцию (синтез и всасывание витаминов К, группы В, биотина, никотиновой кислоты), способствуют синтезу незаменимых аминокислот. Метаболиты бифидо- и лактобактерий препятствуют микробному декарбоксилированию гистидина и повышению количества гистамина. Лактобактерии образуют молочную кислоту, продуцируют лизоцим, лизин, ацидофилин. Кишечная палочка способствует синтезу иммуноглобулинов, вырабатывает канцеролитические вещества.

Анаэробы продуцируют БАВы, медиаторы, которые влияют на функции ЖКТ, печени, сердесно-сосудистой системы, кроветворение и обменные процессы.

Нормофлора способна утилизировать не переваренные пищевые субстраты, образуя органические кислоты, аминокислоты, нормализующие обмен в организме.

Положительные функции нормофлоры:

1. колонизационная резистентность.

2. синтетическая (способность продуцировать витамины, гормоны, антибиотики).

3. поддержание высокого уровня содержания лизоцима, секреторных иммуномодулинов, интерферонов.

4. детоксикация экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов.

5. обменная (участие в обмене в-в).

6. пищеварительная (морфокинетическое влияние на слизистые оболочки, абсобцию абиотических компонентов, транзит нутриентов, газовый состав, мышечный тонус кишечника, перистальтику кишечника, эвакуацию кишечного содержимого).

Дисбактериоз - это нарушение состава и свойств микрофлоры. Чаще всего проявляется дисбактериоз кишечника. Наиболее частая причина дисбактериоза – лечение антибактериальным препаратами (антибитики, сульфаниламиды и т.д.). По большому счету, любые препараты и любые способы терапии, подавляющие иммунитет способствуют развитию дисбактериоза (кортикостероидные гормоны, лучевая терапия, использование средств подавляющих рост опухолей и т.п.). Еще одна причина дисбактериоза - нарушения питания. Это и однообразная пища, и различные злоупотребления (жирным, сладким), и тяга населения к экспериментам над собой (голодание, уринотерапия, кефирная диета, яблочные дни, банановые недели). гастриты, дуодениты, язвы, панкреатиты, колиты и т.п. обуславливают возникновение дисбактериоза. Вполне естественно, что любое оперативное вмешательство на органах системы пищеварения тоже приведет к возникновению дисбактериоза. Инфекционные болезни - особенно и, пожалуй, прежде всего, кишечные инфекции - тоже вызывают дисбактериоз.

Для профилактики и лечения дисбактериоза применяют препараты нормальной микрофлоры кишечника – эубиотики (пробиотики). Пробиотики – ЛП, которые в своем составе содержат живые клетки специально подобранных штаммов м/о растительно или животного происхождения. Они выживают в условиях кислотно окружения, непатогены, нетоксичны, стабильны в течение длительного срока хранения. Положительное влияние пробиотиков: 1) подавляют микробные патогенны за счет продукции антибактериальных веществ, а также конкуренции за лимитирующие пит.в-ва и сайты адгезии на кишечной стенке. 2) влияют на ферментативную активность кишечных м/о. 3) стимулируют иммунную систему макроорганизма. Препараты: бифидумбактерин, бификол, лактобактерин, бактесубтил, линекс, энтерол.

Пребиотики – пищевые добавки, селективно стимулирующие рост и размножение нормофлоры. Это низкомолекулярные углеводы (фруктозоолигосахариды, инулин, лактулоза), которые не должны подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами.

Симбиотики – комплексные препараты, содержащие пробиотики и пребиотики.

Существуют препараты, воздействующие на патогенную микрофлору продуктами метаболизма нормофлоры. К ним относится хилак-форте – стерильные концентрат продуктов обменв в-в нормофлоры(молочную кислоту, лактозу, аминокислоты, жирные кислоты). Эти в-ва способствуют восстановлению в кишечнике биологической среды и подавляют рост патогенных м/о.

Гнотобиология (греч. gnōtos указанный, известный + биология; син. гнотобиотика) — отрасль экспериментальной биологии и медицины, занимающаяся получением и выращиванием стерильных животных, а также животных, микрофлора которых состоит из точно известных одного или нескольких видов микроорганизмов, с целью изучения механизмов и форм взаимодействия микроба с макроорганизмом.

Гнотобионты [от греч. gnotos — известный, определенный и бионт (ы)], безмикробные животные и животные, выращенные в стерильных условиях в период постнатального развития. Обычно Гнотобионты получают путем кесарева сечения и содержат в специальных боксах, в которых отсутствуют микробы (подаются стерильный воздух, пища, вода). Гнотобионты не подвержены воздействию сапрофитной или патогенной микрофлоры воздуха, вследствие этого, в отличие от обычных животных, их реакции на воздействие факторов окружающей среды более выражены.

 

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...