 |
Реакция нейтрализации токсина анатоксином
|
|
|
|
Цель: Определение активности комплемента или гемолитической сыворотки
Компоненты: 1. Белковые токсины бактерий 2. Антитоксины
Механизм:Взаимодействии между экзотоксином (антигеном) и специфической антитоксической сывороткой (антитеаом — антитоксином), в результате чего образуется комплекс «антиген + антитело», и экзотоксин теряет свои токсические свойства.
Методы постановки:
Реакция нейтрализации invivo. Исследуемый материал, в котором предполагают присутствие экзотоксина (определяемый антиген) смешивают со специфической антитоксической сывороткой (известные антитела), выдерживают смесь в термостате и затем вводят лабораторным животным (чаще используют мышей или морских свинок). Если произошла реакция нейтрализации, то животные остаются живыми.
Реакция in vitro.
В пять пробирок наливают по 2,0 мл токсина и возрастающие количества испытуемой антитоксической сыворотки. После инкубации при 45°С в течение 30 мин отмечают пробирку, где раньше всего наступила флоккуляция и имеется соответствие количества токсина количеству международных единиц сыворотки. В пробирках справа находятся смеси ингредиентов с преобладанием антитоксина, а в пробирках слева -смеси в с превышением антигена
Внешнее проявление реакции- Флокуляция
Цель:Для выявления в исследуемом материале экзотоксина с помощью известной стандартной диагностической антитоксической сыворотки.
Гемолиз Титрование комплемента Титр и рабочая доза
Тип реакции - реакция иммунного гемолиза.
Исследуемый материал - свежая сыворотка крови.
Дополнительные ингредиенты реакции: гемолитическая система (гемолитическая сыворотка в рабочей дозе и 3% взвесь эритроцитов барана).
|
|
|
Положительная реакция - гемолиз; отрицательная - задержка гемолиза.
Титр комплемента - наибольшее разведение комплемента, в котором наблюдается гемолиз.
Применение: для определения титра комплемента. Если речь идет о титровании комплемента перед постановкой РСК, то титр определяют для дальнейшего расчета рабочей дозы. Используется разведение на 25% концентрированнее, чем титр.
РСК
Реакция связывания комплемента
Цель: серодиагностика: определение Ат в сыворотке пациента; сероидентификация: определение Аг (исследуемый материал).
Сущность - используется две конкурирующие системы Аг и Ат и один комплемент. Реакция связывания комплемента 1 система – основная (исследуемая или тест-система):
Серодиагностика: сыворотка больного (Ат) + антиген + комплемент (реакция связывания комплемента).
Сероидентификация: исследуемый материал, содержащий Аг (моча, ликвор, носоглоточный смыв и др.) + диагностическая сыворотка (известные Ат) + комплемент (реакция связывания комплемента).
Реакция связывания комплемента 2 система - индикаторная или гемолитическая: выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы: эритроциты барана и антиглобулиновая кроличья сыворотка - свободный комплемент вызывает гемолиз. При отсутствии свободного комплемента (связывание с 1 системой) – задержка гемолиза
РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для;
1) серологической диагностики инфекционных заболеваний
2) идентификации бактерии и др. микробов.
РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ- АТ-, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.
РСК проводится в два этапа при участии двух систем:
1) Первая система — АГ+АТ-(-комплемент — обуславливает связывание комплемента в том случае, если АТ соответствует АГ, В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным;
2) Вторая система (индикаторная) — гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты — показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т.к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент.
|
|
|
Компоненты реакции:
1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 «С в течение 30 минут);
2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов);
3) комплемент;
4) гемолитическая сыворотка;
5) 3 % взвесь эритроцитов барана,
6) физиологический раствор;
7) контрольная сыворотка.
Комплемент, В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.
Титр комплемента — наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.
Рабочая доза комплемента — количество комплемента, которое выше тира на 25 %.
Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50 % взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 °С. Определяют титр и рабочую дозу.
Титр сыворотки — максимальное разведение сыворотки, которая вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.
74 Современные серологические реакции с меткой Особенности: Используют метку (флюоресцеин, фермент или изотоп), которую соединяют (конъюгируют) с Аг или Ат. Реакции происходят быстрее (экспресс) и качественнее. Высокочувствительны и возможна точная регистрация специальными приборами. Их проводят на стекле или полистироловых планшетках с лунками.
|
|
|
Требования к меткам: Не изменять специфичность Ат и Аг; Быстро и легко выявляться; Определяться количественно. Современные серологические реакции с меткой Основные виды меток: Светящиеся красители – флюорохромы (РИФ); Электронно-плотные белки (ИЭМ); Ферменты (ИФА); Радиоактивные изотопы (РИА).
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, реакция Кунса) ПРЯМОЙ МЕТОД: Бактерия в мазке + сыворотка, меченная флюорохромом = свечение в виде каймы зеленого цвета. НЕПРЯМОЙ МЕТОД: 1) бактерия в мазке + кроличья диагностическая сыворотка, 2) отмывание антител, не связавшихся с антигенами бактерий, 3) + антиглобулиновая (антикроличья) сыворотка, меченная флюорохромом = свечение в виде каймы зеленого цвета. Иммуноферментный анализ Наиболее распространен твердофазный ИФА – когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. Иммуноферментный анализ Фермент: пероксидаза хрена -галактозидаза щелочная фосфатаза Иммуноферментный анализ Цель – серодиагностика (идентификация Ат) 1) сорбированный в лунке антиген + сыворотка больного, 2) отмывание несвязавшихся реагентов путём тщательного промывания лунки, 3) + антиглобулиновая (античеловеческая) сыворотка, меченная ферментом, 4) отмывание несвязавшихся реагентов путём тщательного промывания лунки, 4) + субстрат для фермента + хромоген = изменение цвета хромогена. Иммуноферментный анализ Цель: сероидентификация (идентификации антигена) В лунке сорбируют специфические антитела + искомый антиген + иммунная сыворотка против антигена, меченная ферментом + субстрат для фермента + хромоген (метод «сэндвича»). ИФА применяют для диагностики инфекций, определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях – 10-12 г/л.
|
|
|
Радиоиммунологический анализ Сущность: аналогичен ИФА.
Недостатки: метод представляет определенную экологическую опасность. РАДИОНУКЛИДЫ 125I, 14C, 3H, 51 Cr и др.
Иммуноблотинг электрофоретическое разделение антигенов в полиакриламидном геле; перенос их на микропористую нитроцеллюлозную мембрану; обработка моноклональными антителами; выявление преципитатов с помощью меченной антиглобулиновой сыворотки (напр. в РИФ, ИФА). НЕПОЛНЫЕ АНТИТЕЛА одновалентные антитела, не образующие видимого глазом гигантского иммунного комплекса в ходе реакций агглютинации или преципитации блокирующие антитела, реагины
климат, воздержанные солнечные ванны. Не лишней будет и витаминная терапия и т.д.
|
|
|
