 |
Получение геномной библиотеки с помощью плазмидных векторов
|
|
|
|
Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.
Рекомбинантная ДНК
"...Рекомбинантная ДНК - молекула ДНК, полученная в результате объединения in vitro чужеродных (в природе никогда вместе не существующих) фрагментов ДНК с использованием методов генной инженерии
18. Клонирующий вектор, вектор клонирования (cloning vector) [лат. vector — везущий, несущий; греч. clon — отпрыск, ветвь] — рекомбинантный вектор (см. Вектор), содержащий сайты рестрикции, по которым в него может быть встроен любой подлежащий клонированию чужеродный фрагмент ДНК, и способный к автономной репликации в бактериальных, дрожжевых или иных клетках.
Векторы экспрессирующие: конструирование: общие сведения
Экспрессия клонированных генов является одной из основных задач генной инженерии. Для получения полноценной экспрессии клонированных генов используют экспрессирующие векторные системы, принципы конструирования которых разработаны.
Любой полноценный в функциональном отношении ген, в том числе и рекомбинантный, состоит из регуляторной и структурной частей. Генетический код, с помощью которого последовательность нуклеотидов в кодирующей структурной части гена определяет последовательность аминокислот в кодируемом этим геном белке, универсален для всех организмов. Это дает принципиальную возможность получения полноценной экспрессии самых разнообразных осмысленных последовательностей нуклеотидов, в том числе и искусственно синтезированных, в любом природном генетическом окружении.
|
|
|
Регуляторная часть генов распознается соответствующими ферментными системами организма и обеспечивает экспрессию его структурной части. Регуляторная часть гена высокоспецифична в отношении природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего она не может эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. При конструировании экспрессирующих векторов необходимо учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген предполагается экспрессировать.
Не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Структурные части генов про- и эукариот отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов многочисленных и протяженных некодирующих последовательностей нуклеотидов - интронов.
Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в клетках прокариот, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3'- и 5'-концевых некодирующих последовательностей.
19. Библиотеки кДНК.
Библиотека кДНК (cDNA library) — несистематизированный набор рекомбинантных молекул, которые содержат синтезированные in vitro комплементарные копии (кДНК) всех мРНК определенного типа клеток (тканей).
|
|
|
Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).
Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается.
Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.
Как источник клонирования генов для некоторых приложений комплементарные последовательности ДНК предпочтительнее геномных библиотек, поскольку:
• кДНК содержит только экзоны гена и, следовательно, прямое представление кодирующей последовательности гена без интронов и промотора;
• комплекты кДНК, представляющие копии одного гена, могут отличаться, что указывает на наличие альтернативных промоторов, или точек полиаденилирования, или различных точек сплайсинга, так что некоторые экзоны могут или включаться, или исключаться из некоторых копий;
• использование конкретного источника мРНК в значительной степени увеличивает число копий известного гена, выборочно экспрессированного в этой ткани.
Созданы тысячи библиотек кДНК из различных тканей или из одних и тех же тканей, взятых на различных стадиях развития многих организмов. Они стали бесценным источником кДНК для обширного массива копий мРНК. Получение большой библиотеки увеличивает шансы того, что любая интересующая мРНК, независимо от того, насколько она редка, будет, по крайней мере, один раз представлена в библиотеке.
|
|
|
Суть метода ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR – polymerase chain reaction) – метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце.
Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям. Синонимом процесса копирования ДНК является «амплификация». Репликация ДНК in vivo также может считаться амплификацией. Однако в отличие от репликации, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются короткие участки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидов).
Основные принципы
Итак, ПЦР - это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?
Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают "праймеры" (затравки) - синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК - двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:
денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) - 95°С - 1 или 2 минуты;
отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) - 60°С (к примеру) - 1 минута;
элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) - 72°С - 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).
Кратко: Принцип метода ПЦР заключается в «строительстве» новых ДНК или РНК инфекций. Без удаления клеточного материала осуществить это невозможно. Количество времени, затраченного на выделение ДНК, зависит от возбудителя инфекции и от вида используемого для исследования методом ПЦР материала. Например, для подготовки крови к следующему этапу требуется 1,5–2 часа.
ПЦР состоит из трех основных этапов:
1. подготовки исследуемой пробы материала, которая в большинстве случаев сводится к выделению ДНК или РНК;
2. собственно полимеразной цепной реакции;
|
|
|
