Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Методы секвенирования: секвенирование ДНК по Сэнгеру, современные методы секвенирования.




Секвенирование – расшифровка последовательности ДНК.

Методы секвенирования:

а) секвенирование по Сэнгеру;

б) пиросеквенирование;

в) секвенирование следующего поколения;

г) полупроводниковый секвенатор.

Полимеразы, используемые при секвенировании ДНК:

а) Фрагмент Кленова (ДНК-полимеразы I из E.сoli) с отсутствующей экзонуклеазной активностью, расщепляющей ДНК в направлении 5'-3. Фрагмент сохраняет полимеразную и 3'-5' экзонуклеазную активности.

б) Рекомбинантные ДНК-полимеразы, отвечающие следующим требованиям: - отсутствие 3'- и 5'-экзонуклеазной активности,

- отсутствие дискриминации по включению в растущую цепь как обычных, так и модифицированных (меченных) ddNTP.

в) Термостабильные полимеразы для секвенирования:

-Thermo Sequenase™, Amersham Pharmacia Biotech

- AmpliTaq FS™, PE Biosystems

Секвенирование по Сэнгеру:

1. «Плюс-минус» метод, 1975

В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые при гидролизе рестрицирующими эндонуклеазами, а в качестве фермента - фрагмент Кленова ДНК полимеразы I (PolI) из E.coli. Метод включал два этапа. Сначала в ограниченных условиях проводили полимеразную реакцию в присутствии всех четырех типов dNTP (один из них был мечен по альфа-положению фосфата), получая на выходе набор продуктов неполного копирования матричного фрагмента. Смесь очищали от несвязавшихся дезоксинуклеозидтрифосфатов и делили на восемь частей. После чего в "плюс" системе проводили четыре реакции в присутствии каждого из четырех типов нуклеотидов, а в "минус" системе - в отсутствие каждого из них. В результате, в "минус" системе терминация происходила перед dNTP данного типа, а в "плюс" системе - после него. Полученные таким образом восемь образцов разделяли с помощью электрофореза, "считывали" сигнал и определяли последовательность исходной ДНК. Этим способом была секвенирована короткая ДНК фага фХ174, состоящая из 5386 нуклеотидных пар.

2. Метод «терминаторов», 1977

В основе метода лежит ферментативное копирование с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I из E.coli. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивали добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирали экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требовалось провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгонялись в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определялась последовательность нуклеотидов.

 

№22 Ученые в молекулярной биологии

Джеймс Уотсон

В 1952 году Уотсон и Крик стали работать над моделированием структуры ДНК. Используя правила Чаргаффа и рентгенограммы Розалинды Франклин и Мориса Уилкинса построили двухспиральную модель. Результаты работы опубликовали 30 мая 1953 года в журнале Nature.

25 лет руководил лабораторией Колд-Спринг-Харбор, где вёл исследования генетики рака.

С 1989 года по 1992 год — организатор и руководитель проекта «Геном человека» по расшифровке последовательности человеческой ДНК.

Френсис Крик

В конце 1951 г. Крик начал работать с Д. Уотсоном в Кавендишской лаборатории в Кембриджском университете. Успех принесла «фотография 51» — рентгенограмма ДНК, полученная Розалинд Франклин и её аспирантом Реймондом Гослингом. Фотография была передана сотруднику лаборатории Морису Уилкинсу, Уотсон и Крик вместе разработали модель спиральной структуры ДНК. В 1953 году они опубликовали свои результаты. За эту и последующие работы Джеймс Уотсон, Фрэнсис Крик совместно с Морисом Уилкинсом в 1962 году получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Во второй половине 1950-х годов Крик пытался теоретически определить механизм синтеза белка. К 1958 году он перечислил ключевые особенности процесса синтеза белка:

  • генетическая информация хранится в виде молекул ДНК
  • матричная РНК содержит информацию для создания одного белка
  • адапторные молекулы (adaptor molecules) ставят в соответствие фрагменты матричной РНК с аминокислотами будущего белка
  • рибосомо-белковые комплексы (ribonucleic-protein complexes) катализируют сборку аминокислот в белок в соответствии с матричной РНК

Крик впервые ввёл термин «центральная догма» молекулярной биологии (который используется и сегодня) для представления одностороннего перехода генетической информации по механизму:

ДНК —> РНК — > белок («Информация передаётся от нуклеиновых кислот к белку, но не в обратном направлении»).

3. Морис Уилкинс

лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине 1962 года (совместно с Джеймсом Уотсоном и Фрэнсисом Криком) «за открытия, касающиеся молекулярной структуры нуклеиновых кислот и их значения для передачи информации в живой материи». Внёс вклад в такие области научного знания, как фосфоресценция, разделение изотопов, оптическая микроскопия и рентгеновская дифракция, а также усовершенствовал радар. Морис Уилкинс широко известен благодаря работе по определению структуры ДНК в Королевском колледже Лондонского университета

Розалинд Франклин

Розалинд Франклин известна в большей степени своей работой над получением рентгенограмм структуры ДНК. Сделанные ею снимки отличались особой чёткостью и, по некоторым сведениям, послужили основанием для выводов о структуре ДНК, сделанных и опубликованных впоследствии в журнале «Nature» работавшими в Кавендишской лаборатории Кембриджского университета Джеймсом Уотсоном и Фрэнсисом Криком. В 1955 Франклин и Дон Каспар написали работы, опубликованные в Nature, которые, вместе взятые, демонстрировали, что молекула РНК идет по спирали на внутренней поверхности полого тела вируса табачной мозаики.

Эрвин Чаргафф

Главным направлением научной деятельности было изучение химического состава и структуры нуклеиновых кислот. Эрвин Чаргафф определил количественное отношение азотистых оснований, входящих в их состав. В 1950 — 1953 годах им было показано, что общее количество адениновых остатков в каждой молекуле ДНК равно количеству тиминовых остатков, а количество гуаниновых остатков — количеству цитозиновых. Правила Чаргаффа использовали Френсис Крик и Джеймс Уотсон при определении структуры ДНК в виде двойной спирали. Также Чаргафф доказал, что ДНК обладает видовой специфичностью, и отверг гипотезы о существовании многих разновидностей ДНК. Эрвин Чаргафф был первым, кто начал исследовать денатурацию ДНК. Кроме того, он занимался исследованием свертывания крови, изучал липиды и липопротеины и метаболизм аминокислот.

Хар Корана

Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1968 году (совместно с Робертом Холлеем и Маршаллом Ниренбергом) «за расшифровку генетического кода и его роли в синтезе белков». В 1954 году Корана опубликовал работу, в которой описывал синтез АДФ и АТФ с помощью карбодиимидной реакции. Он хотел синтезировать ген. И ему это удалось: впервыe ген был xимически синтезирован им в 1970 году, затем Корана синтезировал ген, родственный первому, и в 1979 году продемонстрировал, что они функционируют в бактерии. на счету которого много примечательных достижений, в том числе первый практический синтез нуклеотидов и коферментов в середине 1950-х. Он был одним из первых учёных, начавших работать на стыке нескольких наук (таких как физика, химия и биология), и первым ввёл термин «химическая биология». В 1972 году Гобинд описал полный химический синтез функциональных генов тРНК, что стало беспрецедентным и до сих пор непревзойдённым достижением в области химической биологии. Также Корана был первым учёным, синтезировавшим олигонуклеотиды[12].

7. Роберт Холлей,
Холлей разделил Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1968 г. с Харом Гобиндом Картой и Маршаллом Ниренбергом «за расшифровку генетического кода и его роли в синтезе белка

Маршал Ниренберг

Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1968 году (совместно с Робертом Холли и Харом Гобиндом Кораной) «за расшифровку генетического кода и его роли в синтезе белков»

В 1960 году к Ниренбергу совместно с Дж. Генрих Маттеи начал изучение нуклеотидов. Ниренберг и Маттеи вне бактерии создали синтетическую молекулу РНК и экспрессировали её в E.coli

Кэри Мюллис

Работая в компании Cetus, Муллис разработал метод полимеразной цепной реакции, который революционизировал молекулярную биологию и медицину. В 1993 году он получил за это Нобелевскую премию по химии.

Метод включает четыре компонента: сегмент двойной спирали ДНК, называемый темплатной ДНК, который следует копировать, два олигонуклеотидных праймера (короткие отрезкив односпиральной ДНК, каждый из которых комплементарен одной из коротких последовательностей темплатной ДНК), нуклеотиды – химические строительные блоки, из которых строится молекула ДНК, и фермент полимераза, который копирует темплатную ДНК, присоединяя к ней свободные нуклеотиды в правильной последовательности.

Эти ингредиенты нагревают, что вызывает разъединение двойной спирали темплатной ДНК на отдельные спирали. Смесь охлаждают, чтобы праймеры связались с комплементарными концами отрезков темплатных цепей. Затем полимераза начинает копировать темплатные отрезки присоединением нуклеотидов на один из концов праймеров и в итоге производя двойную спираль ДНК.

Повторение цикла увеличивает количество ДНК по экспоненте: каждые 30 циклов, что занимает всего несколько минут, дают более миллиарда копий исходной последовательности ДНК.

Майкл Смит

В 1960 Смит перешел в Институт исследований ферментов при Висконсинском университете, где работал над синтезом олигорибонуклеотидов, самой острой в то время химической проблемой в области нуклеиновых кислот.

Первым разработал метод направленного мутагенеза в начале 1970-х и несколько лет его совершенствовал. В 1978 Смит и его сотрудники достигли первых успехов в направленном мутагенезе молекулы ДНК бактериофага, а в 1982 они уже смогли производить большие количества фермента, в котором с помощью своего метода заменяли любую выбранную аминокислоту в аминокислотной последовательности фермента.

Эндрю Файр

В 2006 получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине вместе с Крейгом Мелло за «открытие РНК интерференции — подавления экспрессии генов двухцепочечной РНК». Исследования были проведены в Институте Карнеги в Вашингтоне, результаты были опубликованы в 1998 Крейг Мелло,

Венкатраман Рамакришнан

лауреат Нобелевской премии по химии за 2009 год совместно с Томасом Стейцем и Адой Йонат с формулировкой «за исследования структуры и функций рибосомы, принимал участие в анализе структуры рибосом методом рентгеновской кристаллографии. На основании полученных данных были построены трехмерные модели рибосом, которые используются при создании новых антибиотиков.

Томас Штейтц

лауреат Нобелевской премии по химии за 2009 год совместно с Венкатраманом Рамакришнаном и Адой Йонат с формулировкой «за исследования структуры и функций рибосомы».

Ада Йонат

лауреат Нобелевской премии по химии за 2009 год совместно с Венкатраманом Рамакришнаном и Томасом Стейцем с формулировкой «за исследования структуры и функций рибосомы». Ада Йонат была одним из пионеров в области исследований рибосомы. Помимо этого, она первой применила методику низкотемпературной белковой кристаллографии. Её исследования воздействия антибиотиков на рибосому и механизмов сопротивления организма антибиотикам были важным шагом в процессе изучения клинической эффективности лекарственной терапии

Элизабет Блэкберн

лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине за 2009 год совместно с Кэрол Грейдер и Джеком Шостаком с формулировкой «за открытие механизмов защиты хромосом теломерами и фермента теломеразы». В 1985 году Блэкберн вместе с Кэрол Грейдер открыла фермент теломеразу.

Кэрол Грейдер

лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине за 2009 год совместно с Элизабет Блэкбёрн и Джеком Шостаком с формулировкой «за открытие механизмов защиты хромосом теломерами и фермента теломеразы»

Джек Шостак.

лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине за 2009 год совместно с Кэрол Грейдер и Элизабет Блэкбёрн с формулировкой «за открытие механизмов защиты хромосом теломерами и фермента теломеразы». Ему первому в мире удалось сконструировать искусственную дрожжевую хромосому. Он активно участвовал в проекте «Геном человека». Кроме этого, работы Шостака помогли понять механизм рекомбинации хромосом.

 

1) RFLP (restriction fragment length polymorphism; полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) – первый метод молекулярных маркеров для профилирования ДНК. Метод основан на технике расщепления с помощью особых рестрикционных ферментов (эндонуклеаз рестрикции) молекул ДНК, различающихся в гомологичных участках и соответственно мест рестрикции, и сравнении длин полученных фрагментов различных видов и даже линий живых организмов. Полученные фрагменты разделяются электрофоретически. После переноса на мембрану они идентифицируются гибридизацией с радиоактивно мечеными пробами (Southern blotting). Гибридизация позволяет определять длины фрагментов, комплементарных пробам. Каждый фрагмент рассматривается как аллель и используется в генетическом анализе. Достаточная степень полиморфизма, кодоминантность, частота и равномерное распределение по геному, высокая воспроизводимость позволили использовать метод в ДНК профилировании, картировании генома, локализации генов, имеющих отношение к болезням, генотипировании, изучении филогенеза. Согласно PubMed данным (plant+RFLP), максимальное количество публикаций с использованием этих маркеров приходится на 2003-2005 гг. Определенные недостатки метода – необходимость больших количеств ДНК высокого качества, использование изотопов, продолжительность анализа и др. Соответствующее развитие более эффективных и дешевых типов маркеров к настоящему моменту существенно снизили использование RFLP анализа.

2) RAPD (random amplified polymorphic DNA; амплифицируемые ДНК фрагменты) – метод амплификации ДНК сегментов с использованием случайных праймеров (примерно 10 нуклеотидов) не требует предварительного знания последовательности ДНК, однако вследствие стохастической природы ДНК амплификации важна оптимизация и поддержание соответствующих условий для получения воспроизводимых результатов. Метод используется, например, для изучения близкородственных видов и молекулярной идентичности растений, размножаемых in vitro [13, 14, 15]. Недостатками метода являются: доминантность, не очень хорошая воспроизводимость и необходимость высокоочищенной неконтаминированной ДНК, поскольку использование коротких случайных праймеров может приводить к амплификации фрагментов различных организмов; локус-неспецифичность маркеров и негомологичность фрагментов одинакового размера (homoplasy). Вследствие недостаточной воспроизводмиости RAPDs сложно использовать в межлабораторных исследованиях. Вследствие вышеупомянутого значимость получаемых результатов и их интерпретация могут подвергаться сомнению.

3) EST-SSR (ESTs, expressed sequence tag, короткие фрагменты последовательностей клонированных участков ДНК (mRNA→cDNA)), которые используются для идентификации транскриптов генов, могут быть источниками для выявления SSRs, т.е. для поиска микросателлитов в экспрессируемых участках генома. Поскольку EST последовательности консервативны, межвидовая EST-SSRs ПЦР амплификация, возможно, более успешна, чем SSRs геномной ДНК. Этот тип маркеров представляет интерес, поскольку их разработка недорога, они отражают транскрибируемые гены, чьи предполагаемые функции зачастую могут быть определены с помощью выявления гомологии. Но качество SSR-EST последовательностей очень важно, поскольку дизайн праймеров может быть осложнен рядом обстоятельств: распространением одного или обоих праймеров на участки сплайсинга; наличием больших интронов в последовательности геномной ДНК, использованием «неполноценной» (questionable) информации относительно создания праймера, и созданием праймеров для химерных cDNA клонов. Таким образом, дизайн праймеров успешен на 60-90%. К началу 2013 г. в базах данных (GenBank) доступны более 74 млн. ESTs. Однако создание генных микросателлитных маркеров ограничено теми видами, для которых имеется достаточно большое количество ESTs. С помощью определенных компьютерных программ данные последовательностей ESTs, генов и cDNA клонов могут быть загружены из GenBank и сканированы на выявление SSRs. Приложения использования данного типа маркеров – функциональный геном, ассоциативное картирование, анализ генетического разнообразия, анализ количественных признаков и др. EST-SSR маркеры могут способствовать эволюционному анализу широкого представительства таксонов, анализу видов, ресурсы которых крайне ограничены. Продуктами EST-SSR маркеров являются четкие бэнды, отчетливые аллельные пики. Поскольку эти маркеры являются производными транскриптов, они могут быть использованы для оценки функционального разнообразия естественных популяций или коллекций гермоплазмы. Особенно в случаях маркирования генов, ответственных за фенотипические признаки, эти маркеры полезны для использования в селекции. Как было упомянуто выше, на основе EST-последовательностей разрабатываются и CAPS маркеры.

4) AFLP (amplified fragment length polymorphism; амплификация полиморфных по длине фрагментов ДНК) – метод селективной ПЦР амплификации полиморфных по длине фрагментов, полученных в результате энзиматического расщепления геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции. К полученным после рестрикции фрагментам для селективной амплификации «пришиваются» олигонуклеотидные адаптеры. Таким образом, праймеры состоят из адаптера и последовательности нескольких нуклеотидов (1-5), специфичных для узнавания ферментом рестрикции. Полиморфизм фрагментов по длине (обычно несколько десятков на реакцию), обусловленный множеством геномных сайтов рестрикции, выявляется при электрофорезе. Воспроизводимость и высокое количество информативных фрагментов в реакции позволяет использовать метод в различных аспектах: изучение генетической идентичности, идентификация сортов и клонов, филогенетические связи, картирование, MAS и др. Реализация метода требует высокого качества ДНК. Хотя использование AFLPs, как и RAPDs, не требует предварительного знания ДНК последовательностей, эти типы маркеров сложно использовать при изучении различных популяций или даже видов. Недостатками AFLPs являются доминантность аллелей, возможная негомологичность одинаковых по длине фрагментов – гомоплазия. В случае вставки между соседними местами рестрикции наблюдается утрата короткого фрагмента и появление более длинного. При использовании доминантных маркеров, например, в диплоидах один бэнд имеет место в случаях, если одна или обе гомологичные хромосомы содержат амплифицируемую последовательность, т.е. невозможно различить гомо- и гетерозиготы. В полиплоидах неясность усугубляется, поскольку даже в случае выявления определенного бэнда тем более трудно сказать, в каком количестве аллель присутствует [22]. Тем не менее, использование AFLP маркеров в течение последнего десятилетия (PubMed) практически не снижалось. Метод используется при изучении эволюционных и экологических аспектов живых организмов, при сохранении видов.

 

 

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...