Новая техника: мечение аминокислот

В начале 50‑х гг. вышел ряд работ по результатам исследований в лабораториях Генри Борсука (Калифорнийский Технологический институт), Туре Хюльтина (Швеция), Нормана Ли и Роберта Уильямса (Гарвард) и Элизабет Келлер из группы Пола Замецника (Массачусетский госпиталь, Бостон). Все они следили за процессом белкового метаболизма в животных тканях, используя аминокислоты, меченные радиоактивными или тяжелыми изотопами. Из всех этих исследований вытекало, что микросомные частицы следует, видимо, рассматривать как первичные топологические структуры, которые участвуют в образовании пептидных связей[113]. Радиоактивные изотопы поступили в распоряжение исследователей вскоре после окончания Второй мировой войны. Недолгое время спустя начали продаваться радиоактивно меченные аминокислоты. Как и в случае с высокоскоростным центрифугированием клеточных фракций, изучение маркирующего действия радиоактивных аминокислот прошло через стадию испытаний, калибровки и создания экспериментальных установок, прежде чем эта техника превратилась в надежный инструмент для исследования механизмов образования пептидных связей. Однако благодаря ей и в ходе распространения экспериментальных систем, сильно отличавшихся от тех, что использовались на ранних этапах изучения частиц, микросомы, которые до тех пор описывались чисто операционально – по своим седиментационным свойствам, своему химическому составу и своему ферментативным свойствам, – оказались включены в экспериментальное исследование синтеза белка. Происходило это сначала in vivo*, а вскоре и в специально созданных для этого системах in vitro. [114]

От микросомы к рибосоме

К тому времени предостережение Шантрена относительно гетерогенности частиц, образующихся при выделении микросом животных клеток, в значительной мере подтвердилось. На конгрессах и в статьях с отчетами об исследованиях постепенно оказался собран целый «зоопарк» цитоплазматических частиц, представленных множеством видов: одни крупнее, другие мельче, у одних ферментов больше, у других меньше, у одних такой белковый и РНК состав, у других – иной. И при всем этом многообразии поиск биологически активных «очищенных» микросом – если вообще можно было считать эти вещи реально существующими – служил одним из движущих мотивов при разработке систем белкового синтеза, которые методически основывались бы на фракционировании животных, растительных, а затем и бактериальных клеток.

Солюбилизация

Для очищения своих частиц Пол Замецник и его сотрудник Джон Литтлфилд, работавшие в Массачусетском госпитале, использовали растворитель – дезоксихолат натрия[115]. Этот детергент растворял протеино‑ли­пид­ные агрегаты микросомной фракции. После обработки растворителем Литтлфилд успешно седиментировал мелкие частицы при высокой скорости вращения центрифуги (105000 g). Однако выяснилось, что состав рибонуклеиновой кислоты и белков в богатых РНК частицах «рибонуклеопротеина», которые он ресуспендировал из нерастворимого осадка, зависел от концентрации растворителя. И поскольку процесс промывки инактивировал биологическую активность частиц в пробирке, то не было никакой возможности для функционального контроля препарационного протокола. В этой ситуации необходимо было найти альтернативные критерии, которые позволяли бы выявлять «жизнестойкость» получаемых частиц при новой триангуляции. Расширяясь таким образом, исследовательский процесс захватывал медленно, но верно разраставшийся круг ученых, в который входили вирологи, цитологи, биохимики, биофизики и онкологи.

Электронная микроскопия

Одна из техник отображения опиралась на размер и форму частиц. Таким образом соединились два направления исследований: поиск функции микросом и сравнительное изучение клеточных ультраструктур in situ и in vitro посредством электронной микроскопии. У истоков этих работ стояло новаторское электронно‑микроскопическое исследование митохондрий, осуществленное Эрнестом Фуллэмом и Альбертом Клодом в Институте Рокфеллера[116]. Затем последовала еще одна серия исследований, проведенная бывшим соратником Клода Китом Портером; ее успех был обеспечен главным образом новыми техниками фиксации проб и разработкой микротома, с помощью которого можно было изготавливать срезы толщиной от 20 до 50 нанометров[117]. Портер сумел продемонстрировать существование новой цитоплазматической структуры, которую он назвал «эндоплазматическим ретикулумом»[118]. Два года спустя Джордж Пэлэйд, сочетая несколько прогрессивных техник подготовки препаратов, получил электронно‑микро­ско­пи­ческое изображение in situ, на котором видны были на поверхности эндоплазматического ретикулума мелкие частицы, непроницаемые для электронов[119]. Филип Зикевиц, сконструировавший в лаборатории Замецника первую бесклеточную систему белкового синтеза, основанную на фракциях, в 1954 г. перешел к Пэлэйду в Институт Рокфеллера, принеся с собой свои познания в биохимии. Была поставлена цель: скоррелировать «цитохимические категории», в которых вначале описывались микросомные частицы с «морфологическими категориями», базирующимися на исследованиях методом электронной микроскопии[120]. В ходе этих исследований выяснилось, что полученная путем ультрацентрифугирования микросомная фракция состояла из фрагментов эндоплазматического ретикулума, на которых имелись мелкие частицы, непроницаемые для электронов. Визуализация этих частиц в клетке in situ и в центрифужной фракции приводила к резонансу, который усиливал оба отображения. Такие резонансы характерны для того, что ученые называют «независимым подтверждением», которое они считают важным критерием для отсева потенциальных артефактов.

Поскольку эндоплазматический ретикулум отличали от мелких плотных частиц, прилепившихся к нему, то предпринимались, естественно, попытки отделить эти гранулы в качестве «чистых частиц» от остальной неочищенной микросомной фракции. В нескольких лабораториях так называемые «постмикросомные фракции» были получены благодаря различным операциям – таким, как промывка сахарными растворами, «старение» при различных высоких температурах, инкубация с версеном и насыщение уже упоминавшимся дезоксихолатом. Методы получения оказывали свое воздействие на цитохимическое отображение частиц: поскольку в результате большинства из них получались гранулы, которые примерно наполовину состояли из белков, а наполовину из рибонуклеиновой кислоты, эти частицы стали называть «рибонуклеопротеиновыми», или «РНП‑частицами». Эти структуры вскоре сделались в некотором роде синонимом цитоплазматической РНК, хотя и то, что оставалось после седиментации микросом, тоже обнаруживало довольно постоянное содержание РНК – примерно 10% от всего количества этой кислоты в клетке. Однако в то время никто над ними не задумывался[121].

В противоположность грубой микросомной фракции, содержавшей неодинаковые куски гранулярного мембранного материала, промытые частицы выглядели под электронным микроскопом сравнительно гомогенно[122]. Однако применение электронного микроскопа неизбежно создавало проблему подготовки препарата. Нефиксированные частицы Литтлфилда имели в поперечнике от 19 до 33 нанометров, что само по себе есть уже довольно большой разброс. Обработанные же осмием частицы Пэлэйда имели размеры всего 10–15 нанометров[123]. Проблема величины частиц не могла быть решена одними только визуальными и очевидно инвазивными средствами электронной микроскопии.

Скоростная седиментация

Наряду с электронной микроскопией для описания свойств этих «макромолекул» в арсенале ученых были еще такие средства, как электрофорез и аналитическое центрифугирование с его временными параметрами разделения и коэффициентами седиментации. В период с 1952 по 1954 г. Мэри Питерманн и ее сотрудницы в нью‑йоркском Институте Слоуна Киттеринга (Sloan Kettering Institute, New York) интенсивно экспериментировали с высокоскоростной седиментацией «макромолекул» из раковых тканей крысиной печени[124]. Для частиц крысиной печени они отметили массивный «пик» в районе 50S*. По оптическим снимкам можно было вычислить для частиц Литтлфилда основной пик в 47S. Это было схоже с тем, что описывали Питерманн и ее коллеги. Широкий пик в зоне высоких значений S пропал после обработки материала дезоксихолатом. Однако оставался еще небольшой зубец после частицы в 47S, который не исчезал после процедуры промывки. Вставал, таким образом, вопрос, не является ли рибонуклеопротеиновая частица микросомной фракции гетерогенной внутри самой себя. И вопрос этот опять же нельзя было решить одними только отобразительными средствами аналитической центрифуги.

Ни для одной из техник отображения не существовало какой‑то изначально фиксированной точки отсчета, исходя из которой можно было бы измерять и стандартизировать форму и состав рассматриваемого научного объекта. Скорее, он сам постепенно приобретал контуры за счет коррелирования и наложения самых различных биофизических, биохимических и биологических отображений. Но поскольку материал после изоляции в пробирке уже не был биологически активен, то и отсчет велся сначала от нефункционирующего объекта. Экспериментальные отображения частично согласовывались друг с другом, частично интерферировали, частично взаимно исключали друг друга. Например, «дезоксихолатная» частица возникла в области исследований протеинового синтеза около 1953 г. Три с лишним года по поводу ее спорили, а потом она утратила актуальность и сошла с экспериментальной сцены, потому что никому не удалось доказать, что после обработки дезоксихолатом она еще сохраняла биологическую активность.

В этих эпистемических трансформациях важнейшую роль играли предписания по препарации; соответственно и терминология, в которой описывались результаты, тоже отражала это в значительной степени операциональное пространство. Различные средства и способы отображения – выбор исходного материала, инструменты исследования, физическая технология разделения, биохимический анализ – оказывали друг на друга взаимное воздействие. Более или менее замысловатыми путями отображения обретали значения, которые касались либо морфологических, либо функциональных аспектов частиц, однако сами отображения при этом не сливались друг с другом. Так, например, в интактной клетке in situ с помощью электронного микроскопа можно было различить частицы свободные и частицы, прикрепленные к мембране. Но ни одной из групп исследователей не удалось различить их после гомогенизирования клеток и разделения цитоплазмы в пробирке. При любом варианте центрифугирования выходила не поддающаяся разделению смесь из свободных и прикрепленных к мембране частиц. Это особенно разочаровывало ученых, работавших in vitro, потому что различение этих двух видов гранул под электронным микроскопом привело к далеко идущим гипотезам по поводу разницы их функций: предполагалось, что частицы, прикрепленные к мембране, отвечают за синтез белка, специфичного для данной ткани, в то время как свободные частицы поставляют ферменты для общего обмена веществ[125].

Рибосомы как матрицы

За период с 1940 по 1955 гг. маленькие цитоплазматические частицы проделали огромную эволюцию: из седиментируемых малых митохондрий или их фрагментов, которые уже невозможно разглядеть в обыкновенный оптический микроскоп, они превратились в микросомы, предположительно функционирующие как плазмагены, а из них – в морфогенетическе единицы, затем – в операционально определенные гранулярные элементы цитоплазмы, нерастворимые в дезоксихолате и хлориде натрия, и наконец – в рибонуклеопротеиновые частицы, которые состояли наполовину из белка, наполовину из РНК,были видны в электронный микроскоп и топологически имели отношение к образованию пептидных связей. Браше уже давно предположил, что РНК связана с синтезом белка[126], и поэтому РНК‑составляющая этих частиц становилась постепенно объектом все более пристального внимания, а к середине 50‑х гг. уже все были уверены в том, что она представляет собою «матрицу», на которой аминокислоты соединяются в полипептидные цепи.

В 1958 г. Говард Динцис придумал термин «рибосомы», которым он назвал очищенные микросомы без мембранных фрагментов[127]. Этот неологизм был подхвачен Ричардом Робертсом[128] и в последующие годы распространился в лабораториях и в специальной литературе. Хотя биологические основания для такой перемены термина были, мягко выражаясь, неочевидны, новое название отражало и, более того, подсказывало, в отличие от прежних операциональных терминов, некую молекулярно‑биологическую функцию. «Рибосома» начала проникать в биохимически определенное пространство протеинового синтеза в качестве составной части того, что Фрэнсис Крик выдвинул в то время как «центральную догму» молекулярной биологии[129]: генетическая информация от ДНК передается через РНК к белкам и, будучи однажды реализованной, оттуда уже не может попасть обратно в ДНК. Рибосома стала синонимом промежуточной стадии считывания информации с РНК в процессе экспрессии генов. Тем самым она вступила в царство молекулярной генетики.