 |
Квадрупольная времяпролётная масс-спектрометрия
|
|
|
|
Квадрупольные времяпролётные анализаторы масс обычно совмещаются с устройствами ионизации электроспрея, а в последнее время успешно совмещаются с MALDI. ESI quad-TOF (рис. 2.12) комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой эффективностью, чувствительностью и точностью времяпролётного рефлектронного анализатора масс. Квадруполь может выступать как простой квадрупольный анализатор, чтобы сканировать определённый диапазон m / z. Однако он может быть также использован, чтобы селективно выделить ион-прекурсор и направить его в ячейку столкновения. Получившиеся фрагментарные ионы затем анализируются TOF рефлектронным анализатором масс. Квадрупольный TOF использует способность квадруполя выделять отдельный ион и способность TOF-MS совершать одновременное и точное измерение ионов по всему диапазону масс за короткий период времени. Квадрупольные TOF анализаторы выдают большую чувствительность и точность, нежели тандемные квадрупольные приборы при получении полных фрагментарных масс-спектров.
Квадрупольный TOF прибор может использовать квадрупольный или TOF анализаторы независимо или совместно для тандемных MS экспериментов. TOF компонент прибора имеет больший m / z предел, превышающий 10000. Высокая разрешающая сила (~10000) TOF также обеспечивает хорошую точность измерения массы – порядка 10 ppm. Из-за своей высокой точности и чувствительности, ESI quad-TOF масс-спектрометр внедряются в решение проблем протеомики и фармакокинетики.
Масс-спектрометрия с Фурье-преобразованием (FTMS)
FTMS основана на принципе наблюдения за орбитальным движением заряженных частиц в магнитном поле (рис. 2.13-14). Пока ионы движутся по орбитам, импульсный радиочастотный (RF) сигнал используется для их возбуждения. Это RF возбуждение позволяет ионам продуцировать заметный экранирующий ток, вводя их в когерентное движение и увеличивая радиус орбиты. Экранирующий ток, генерируемый всеми ионами, может быть затем Фурье-преобразован, чтобы получить составляющие частоты различных ионов, которые соотносятся с их m / z. Так как частоты могут быть определены с высокой точностью, соответствующие им m / z также могут быть вычислены с высокой точностью. Важно отметить, что сигнал генерируется только когерентным движением ионов в условиях ультравысокого вакуума (10-11-10-9 Торр). Этот сигнал должен быть измерен за минимальное время (обычно от 500 мс до 1 секунды), чтобы обеспечить высокое разрешение. По мере увеличения давления, сигнал затухает быстрее, вследствие потери когерентности движения из-за столкновений (например, меньше чем за 150 мс) и не позволяет провести измерения с высоким разрешением (рис. 2.14). [15]
|
|
|
 |
Ионы, находящиеся в когерентном циклотронном движении между двумя электродами изображено на рис. 2.13. По мере того, как положительно заряженные ионы двигаются от верхнего электрона и приближаются к нижнему, электрическое поле ионов вынуждает электроны внешней цепи течь и накапливаться на нижнем электроде. На другой половине циклотронной орбиты электроны покидают нижний электрод и накапливаются на верхнем электроде, когда ионы приближаются. Колебательное движение электронов внешней цепи называется экранирующим током. Когда смесь ионов с различными значениями m / z одновременно ускоряется, сигнал экранирующего тока на выходе усилителя представляет собой составной установившийся сигнал с составляющими частотам, соответствующими каждому значению m / z. Проще говоря, все ионы, запертые в ячейке анализатора, возбуждаются до высоких циклотронных орбит при помощи радиочастотного импульса. Составной установившийся сигнал экранирующего тока ионов по мере их релаксации обрабатывается компьютером, и используется преобразование Фурье для выделения индивидуальных циклотронных частот. Влияние давления на сигнал и разрешение продемонстрировано на рис. 2.14.
|
|
|
Вдобавок к высокому разрешению, FTMS также обладает способностью обеспечивать эксперименты с многократными столкновениями (MSn). FTMS способна к исключению всех ионов, кроме нужного. Выделенный ион затем подвергается столкновению с газом (или другой форме возбуждения: лазерному облучению или электронному захвату) для вызывания фрагментации. Анализ масс может быть затем проведён для фрагментов, чтобы получить спектр фрагментации. Высокое разрешение FTMS/MS также даёт точные измерения масс фрагментов.
FTMS является довольно новым методом для биомолекулярного анализа, но множество её преимуществ делают её всё более и более интересной. Сейчас становится всё более обычным объединение ультравысокого разрешения (>105) FTMS с большим разнообразием способов ионизации, включая MALDI, ESI, APCI и EI. Результатом высокой разрешающей способности FTMS анализатора является высокая точность (часто порядка долей ppm) как показано для белка на рис. 2.16, где можно видеть отдельные пики изотопов. Фурье преобразование сигнала ICR значительно увеличивает удобство ICR за счёт одновременного измерения перекрывающихся частот, произведённых внутри ячейки ICR. Индивидуальные частоты могут быть затем легко и точно переведены в m / z ионов.
В общем, увеличение магнитного поля (B) оказывает благоприятный эффект на характеристики. Фурье преобразование IRC сигнала, измеряя перекрывающиеся частоты одновременно, позволяет достичь высокого разрешения и большой точности определения масс без соответствующего уменьшения чувствительности. Это – чёткое отличие от двухсекторными приборами, которые подвержены потерям чувствительности при высочайших разрешении и точности. Высокие возможности разрешения FTMS прямо связаны с полем FTMS сверхпроводящего магнита, так как увеличение разрешения прямо пропорционально полю. Ионная вместимость, так же как MS/MS эксперименты по кинетической скорости увеличиваются пропорционально квадрату величины поля, тем самым увеличивая динамический диапазон и фрагментарную информацию. Одним из препятствий в увеличении B является эффект магнитного зеркала, когда перенос ионов внутрь магнитного поля становится всё более трудным из-за магнитных силовых линий. Также, изготовление высокопольных магнитов с большими отверстиями превосходной гомогенностью поля (для IRC) становится технически всё более сложным. [16]
|
|
|
Магнитное поле влияет на FTMS оборудование следующими путями:
| ||||||||||||
Так как частота иона = K*B*z/m, большее магнитное поле обеспечивает большую частоту для того же m / z, поэтому генерируется больше опорных точек для более точного определения частоты, что ещё больше увеличивает точность (рис. 2.17).
Квадрупольная FTMS и квадрупольной ионной ловушки FTMS анализаторы масс, которые в последнее время стали использоваться, обычно объединяются с ESI устройствами. Квадрупольная FTMS комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой точностью FTMS. Квадруполь может действовать как любой простой квадрупольный анализатор для сканирования по диапазону m / z. Однако он также может быть использован для селективного избирания иона-прекурсора и направления этого иона в ячейку столкновений или на FTMS. Полученные прекурсор и фрагментарные ионы могут быть затем анализированы при помощи FTMS.
Проведение MS/MS экспериментов вне магнитного поля предоставляет некоторые преимущества, так как высокое разрешение в FTMS зависит от высокого вакуума. MS/MS эксперименты включают в себя столкновения при установившемся высоком давлении (10-6 – 10-7 Торр), которое затем необходимо уменьшить, чтобы добиться высокого разрешения (10-10 – 10-9 Торр). Проведение MS/MS экспериментов вне ячейки, тем самым, оказывается быстрее, так как в IRC ячейке может поддерживаться ультравысокий вакуум. Это делает более новую гибридную компоновку прибора оптимальной по сравнению с комбинацией FTMS/MS с методами разделения, такими как ЖХ.
|
|
|
Таблица 2.2. Общее сравнение анализаторов масс, обычно используемых совместно с ESI. Эти значения могут меняться в зависимости от производителя прибора.
| Квадрупольный | Ионная ловушка | Времяпролётный | Времяпролётный рефлектрон | Магнитный сектор | FTMS | Квадрупольный TOF | |
| Точность | 0.01% (100 ppm) | 0.01% (100 ppm) | 0.02 to 0.2% (200 ppm) | 0.001% (10 ppm) | <0.0005% (<5 ppm) | <0.0005% (<5 ppm) | 0.001% (10 ppm) |
| Разрешение | 4,000 | 4,000 | 8,000 | 15,000 | 30,000 | 100,000 | 10,000 |
| Диапазон m/z | 4,000 | 4,000 | >300,000 | 10,000 | 10,000 | 10,000 | 10,000 |
| Скорость сканирования | ~ секунда | ~ секунда | миллисекунды | миллисекунды | ~ секунда | ~ секунда | ~ секунда |
| Тандемная MS | MS2 (тройной квадруполь) | MSn | MS | MS2 | MS2 | MSn | MS2 |
| Комментарии к тандемной MS | Хорошая точность Хорошее разрешение Низкоэнергетические столкновения | Хорошая точность Хорошее разрешение Низкоэнергетические столкновения | Практически неприменима | Выбор иона-прекурсора ограничен широким диапазоном масс; Растущее число приложений | Ограниченное разрешение Высокоэнергетические столкновения | Отличная точность и разрешение ионов продуктов | Превосходная точность Хорошее разрешение Низкоэнергетические столкновения Высокая чувствительность |
| Общие комментарии | Малая стоимость Лёгкость переключения между +/- ионами | Малая стоимость Лёгкость переключения между +/- ионами | Малая стоимость | Хорошая точность Хорошее разрешение | Прибор громоздкий Возможно высокое разрешение | Высокое разрешение, MSn, Высокий вакуум, сверхпроводниковый магнит, дорогой | Известен высокой чувствительность и точностью при использовании для MS2 |
Детекторы
После того, как ионы разделены анализатором масс, они достигают ионного детектора (рис. 2.1 и 2.18-21), где генерируют токовый сигнал падающих ионов. Самым распространённым детектором является электронный умножитель, который передаёт кинетическую энергию падающих ионов на поверхность, где она, в свою очередь, генерирует вторичные электроны. Однако, существует множество подходов, зависящих от типа масс-спектрометра.
Электронный умножитель
Пожалуй, большинство устройств детектирования ионов включают в себя электронный умножитель (рис. 3.1), который сделан из серии (от 12 до 24) динодов из оксида алюминия, поддерживаемых под увеличивающимся
|
|
|
потенциалом. Ионы ударяют в поверхность первого динода, вызывая испускание электронов. Эти электроны затем притягиваются к следующему диноду, имеющему больший потенциал, и поэтому генерируется больше вторичных электронов. В конце концов, после включения значительного числа динодов, образуется каскад электронов, который даёт общий ток больше в миллион раз и даже ещё больше.
Высокоэнергетический динод (HED) использует ускоряющее электростатическое поле для увеличения скорости ионов. Так как сигнал электронного умножителя сильно зависит от скорости иона, HED служит для увеличения интенсивности сигнала, а, следовательно, и чувствительности.
Цилиндр Фарадея
Включает в себя удар ионов по поверхности динода (BeO, GaP или CsSb), который вызывает выброс вторичных электронов. Этот временный выброс электронов вызывает положительный заряд на детекторе, и поэтому ток электронов по направлению к детектору. Такой детектор не особенно чувствителен, давая очень ограниченное усиление сигнала, но зато он устойчив к относительно высокому давлению.
|
|
|
