 |
44. Лабораторная диагностика сифилиса.
|
|
|
|
44. Лабораторная диагностика сифилиса.
Для лабораторной диагностики сифилиса применяются прямые и непрямые методы. Прямые методы диагностики выявляют самого возбудителя или его генетический материал. К непрямым методам диагностики сифилиса относятся тесты, выявляющие антитела к возбудителю сифилиса в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости. Абсолютным доказательством наличия заболевания является обнаружение бледной трепонемы в образцах, полученных из очагов поражений, с помощью микроскопического исследования в темном поле зрения, иммуногистохимического исследования с использованием моноклональных или поликлональных антител, а также выявление специфической ДНК и РНК возбудителя молекулярно-биологическими методами с использованием тест-систем, разрешенных к медицинскому применению в Российской Федерации. Прямые методы используются для диагностики ранних форм заболевания (первичный и вторичный сифилис) с клиническими проявлениями (эрозивно-язвенные элементы), для подтверждения врожденного сифилиса (ткань пуповины, плаценты, органы плода, отделяемое слизистой оболочки носа, содержимое пузырей, отделяемое с поверхности папул).
Серологические методы диагностики, рекомендуемые для исследования сыворотки крови
Нетрепонемные тесты:
■ реакция микропреципитации (РМП) с плазмой и инактивированной сывороткой или ее аналоги;
■ RPR (РПР) - тест быстрых плазменных реагинов (Rapid Plasma Reagins), или экспресс-тест на реагины плазмы;
■ VDRL - Venereal Disease Research Laboratory test — тест Исследовательской лаборатории венерических заболеваний;
■ TRUST - тест с толуидиновым красным и непрогретой сывороткой (Toluidin Red Unheated Serum Test);
|
|
|
■ USR — тест на реагины с непрогретой сывороткой (Unheated Serum Reagins).
Общая характеристика нетрепонемных тестов:
■ применяется антиген нетрепонемного происхождения (стандартизованный кардиолипиновый антиген);
■ позитивируются через 1-2 недели после образования первичной сифиломы;
■ имеют невысокую чувствительность (до 70-90% при ранних формах сифилиса и до 30% - при поздних), могут давать ложноположительные результаты (3% и более).
Преимущества нетрепонемных тестов:
■ низкая стоимость;
■ техническая простота выполнения;
■ быстрота получения результатов.
Показания к применению нетрепонемных тестов:
■ проведение скрининга населения на сифилис;
■ определение активности течения инфекции (определение титров антител);
■ контроль эффективности терапии (определение титров антител).
Трепонемные тесты:
■ ИФА (иммуноферментный анализ) — высокочувствительный и специфичный тест. Чувствительность при первичном и вторичном сифилисе — 98—100%, специфичность — 96—100%. Дает возможность дифференцированного и суммарного определения IgM и IgG антител к возбудителю сифилиса;
■ иммуноблоттинг является модификацией ИФА. Чувствительность и специфичность - 98-100%. Может применяться для подтверждения диагноза, в особенности при сомнительных или противоречивых результатах других трепонемных тестов.
Относительно новыми для использования в Российской Федерации являются методы выявления трепонемоспецифических антител, основанные на методах иммунохемилюминесценции (ИХЛ) и иммунохроматографии (ИХГ).
■ метод ИХЛ (иммунохемилюминесценции), обладающий высокой чувствительностью и специфичностью (98—100%), дает возможность количественного определения уровня антител к возбудителю сифилиса, может быть использован для подтверждения сифилитической инфекции и скрининга. Ограничения применения: не может быть использован для контроля эффективности терапии, может давать ложноположительный результат.
|
|
|
■ ПБТ (простые быстрые тесты у постели больного, или иммунохроматографические тесты) позволяют проводить быстрое определение содержания трепонемоспецифических антител к возбудителю сифилиса в образцах сыворотки и цельной крови без использования специального лабораторного оборудования и применяться при оказании первичной медико-санитарной помощи, в том числе по эпидемиологическим показаниям. Ограничения применения: не могут быть использованы для контроля эффективности терапии, могут давать ложноположительный результат.
■ РПГА (реакция пассивной гемагглютинации) - высокочувствительный и специфичный тест. Чувствительность метода при первичном сифилисе - 76%, при вторичном -100%, при скрытом – 94-97%, специфичность – 98-100%;
■ РИФ (реакция иммунофлуоресценции, в том числе в модификациях РИФабс и РИФ200) - достаточно чувствительна на всех стадиях сифилиса (чувствительность при первичном сифилисе - 70-100%, при вторичном и позднем - 96-100%), специфичность - 94-100%. РИФ применяется для дифференциации скрытых форм сифилиса и ложноположительных результатов исследований на сифилис;
■ РИБТ (РИТ) (реакция иммобилизации бледных трепонем) - классический тест для выявления специфических трепонемных антител; чувствительность (суммарно по стадиям сифилиса) составляет 87, 7%; специфичность - 100%. Трудоемкий и сложный для постановки тест, требующий значительных средств для проведения тестирования. Сфера применения РИБТ сужается, однако она сохраняет свои позиции как «реакция-арбитр» при дифференциальной диагностике скрытых форм сифилиса с ложноположительными результатами серологических реакций на сифилис.
Общая характеристика трепонемных тестов:
■ применяется антиген трепонемного происхождения;
■ чувствительность – 70-100% (в зависимости от вида теста и стадии сифилиса);
■ специфичность – 94-100%. РИФ, ИФА, иммуноблоттинг (ИБ) становятся положительными с 3-й недели от момента заражения и ранее, РПГА и РИБТ - с 7–8-й.
Преимущества трепонемных тестов:
высокая чувствительность и специфичность.
|
|
|
Показания к применению трепонемных тестов:
■ подтверждение положительных результатов нетрепонемных тестов;
■ подтверждение в случае расхождения результатов скринингового трепонемного теста и последующего нетрепонемного теста, а также скринингового и подтверждающего трепонемных тестов;
■ проведение методами ИФА, РПГА, ИХЛ, ПБТ скрининга отдельных категорий населения на сифилис (доноры, беременные, больные офтальмологических, психоневрологических, кардиологических стационаров, ВИЧ-инфицированные).
Примечания:
■ трепонемные тесты не могут быть использованы для контроля эффективности терапии, т. к. антитрепонемные антитела длительно циркулируют в организме больного, перенесшего сифилитическую инфекцию; ■ трепонемные тесты дают положительные результаты при невенерических трепонематозах и спирохетозах;
■ трепонемные тесты могут давать ложноположительные реакции у больных с аутоиммунными заболеваниями, лепрой, онкологичекими заболеваниями, эндокринной патологией и при некоторых других заболеваниях.
В зависимости от целей серологическое обследование населения на сифилис осуществляется с использованием разных методов:
| Цель обследования | Рекомендуемые тесты |
| Массовый скрининг населения с целью выявления больных с активными формами сифилитической инфекции (поликлиники, стационары общего профиля за исключением специализированных, декретированные контингенты) | Нетрепонемные тесты (РМП, РПР, VDRL и другие аналоги) или иммунохроматографические (трепонемные) тесты |
| Скрининг в особых целевых группах для выявления болеющих сифилисом или лиц, перенесших сифилитическую инфекцию: – беременные, в том числе направляемые на искусственное прерывание беременности; – доноры крови, спермы и тканей; – пациенты специализированных стационаров (офтальмологических, неврологических, психоневрологических, кардиологических); – ВИЧ-инфицированные | Комплекс нетрепонемного (РМП, РПР, VDRL и другие аналоги) и трепонемного (РПГА, ИФА, ИБ, ИХЛ, ИХГ) тестов |
| Диагностика клинических форм приобретенной сифилитической инфекции | Комплекс нетрепонемного (РМП, РПР, VDRL и другие аналоги) в количественном варианте постановки и трепонемного (РПГА, ИФА, ИБ, ИХЛ, ИХГ) тестов |
| Диагностика скрытых и поздних форм приобретенного сифилиса, дифференциальная диагностика скрытого сифилиса и ложноположительных результатов нетрепонемных и трепонемных тестов, подозрение на поздний врожденный сифилис | Комплекс нетрепонемного (РМП, РПР, VDRL и другие аналоги) теста в количественном варианте постановки и не менее двух трепонемных тестов (РПГА, ИФАIgM+IgG, РИФабс/200, РИТ, ИБ ИХЛ |
| Обследование лиц, бывших в половом и тесном бытовом контакте с больным сифилисом, при давности первого контакта не более 2 месяцев | Один их трепонемных тестов (ИФАIgM, ИФАIgM+IgG, РИФабс/200, ИБIgM) |
| Обследование новорожденных с целью выявления врожденного сифилиса | Комплекс нетрепонемного (РМП, РПР, VDRL и другие аналоги) теста в количественном варианте постановки (+ сравнение титров с аналогичными у матери) и трепонемного (РПГА, ИФАIgM, ИФАIgM+IgG, РИФабс/200, ИБIgM) теста. |
| Исследование цереброспинальной жидкости | Комплекс нетрепонемного (РМП, PПP, VDRL) и нескольких трепонемных тестов (РПГА, РИФц, ИФАIgM, ИФАIgM+IgG, ИБIgM, ИБIgG) + определение количества форменных элементов, уровня белка |
| Контроль эффективности терапии | Нетрепонемный тест (РМП, РПР, VDRL и другие аналоги) в количественном варианте постановки и один из трепонемных тестов (РПГА, ИФАIgG, ИФАIgG+IgM, РИФабс/200, ИБ, ИХЛ, РИБТ) |
| Подтверждение реинфекции, дифференциальная диагностика реинфекции с клиническим и серологическим рецидивом | Нетрепонемный тест (РМП, РПР, VDRL и другие аналоги) в количественном варианте постановки и трепонемные тесты (РИФабс/200, ИФАIgM, ИФАIgM+IgG, ИБIgM, РПГА), динамическое наблюдение за уровнем антител |
|
|
|
Ложноположительные серологические реакции на сифилис (ЛПР)
Ложноположительными, или неспецифическими, называют положительные результаты серологических реакций на сифилис у лиц, не страдающих сифилитической инфекцией и не болевших сифилисом в прошлом. ЛПР могут быть обусловлены техническими погрешностями при выполнении исследований и особенностями организма. Условно ЛПР разделяют на острые (< 6 месяцев) и хронические (> 6 месяцев). Острые ЛПР могут наблюдаться при беременности и во время менструации, после вакцинации, после недавно перенесенного инфаркта миокарда, при многих инфекционных заболеваниях (лепра, малярия, респираторные заболевания, грипп, ветряная оспа, вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция) и дерматозах; хронические ЛПР - при аутоиммунных заболеваниях, системных болезнях соединительной ткани, онкологических заболеваниях, хронической патологии печени и желчевыводящих путей, при сердечно-сосудистой и эндокринной патологии, при заболеваниях крови, при хронических заболеваниях легких, при инъекционном применении наркотиков, в старческом возрасте и др. Ложноположительные реакции трепонемных и нетрепонемных тестов могут наблюдаться при эндемических трепонематозах (фрамбезия, пинта, беджель), боррелиозе, лептоспирозе. Пациента с положительными серологическими реакциями на сифилис, прибывшего из страны с эндемическими трепонематозами, необходимо обследовать на сифилис и назначить противосифилитическое лечение, если оно ранее не проводилось. Хронические ложноположительные реакции могут являться преклиническими проявлениями тяжелых заболеваний. Количество ЛПР увеличивается с возрастом. В возрастной группе 80-летних лиц распространенность ЛПР составляет 10%. Ложноотрицательные серологические реакции на сифилис могут наблюдаться при вторичном сифилисе вследствие феномена прозоны при тестировании неразведенной сыворотки, а также при обследовании лиц с иммунодефицитным состоянием, например ВИЧ-инфицированных пациентов.
|
|
|
Принцип микрореакции: при добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген - антитело), выпадающий в виде хлопьев белого цвета.
Возможно проведение качественную и количественную постановки микрореакции с испытуемой плазмой и инактивированной сывороткой крови. Количественный метод используется для контроля излеченности пациента, т. е. снижение титра преципитинов в 2 раза в течении одного года после лечения говорит об успешной терапии и возможности снятия больного с учета.
К моменту снятия леченного больного с учета неспецифические тесты с кардиолипиновым антигеном обычно негативируются, в то время как позитивность специфических реакций может наблюдаться долго после окончания лечения, в связи с чем, эти тесты не могут служить критерием излеченности и больные снимаются с учета с положительными результатами РИТ, РИФ, ИФА, РПГА.
Иммуноферментный анализ.
Принцип иммуноферментного анализа заключается в соединении комплекса " антиген - антитело" с конъюгатом, содержащим ферментную метку, выявляемую с помощью субстратной смеси.
На твердофазном носителе (чаще лунки полистиролового планшета) зафиксирован антиген возбудителя сифилиса, который инкубируется с испытуемой сывороткой, плазмой крови или ликвором. При наличии в этом материале от пациентов противотрепонемных антител происходит их связывание в комплекс " антиген - антитело". Результат реакции оценивается спектрофотометрически с выводом цифровых данных, что исключает субъективность оценки, или визуально, что может быть полезным при отсутствии в лабораториях соответствующего оборудования. По такому принципу в настоящее время построено большинство ИФА тест - систем для диагностики сифилиса.
В зависимости от используемых антигенов все ИФА тест - системы для выявления антител подразделяются на:
1) лизатные (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);
2) рекомбинантные - используются полученные генно - инженерным способом белки - аналоги определенных белковых антигенов возбудителя;
3) пептидные - использующие синтетические фрагменты белков.
Реакция пассивной гемагглютинации
Принцип метода заключается в том, что при соединении сыворотки крови, содержащей специфические антитела, с эритроцитами, сенсибилизированными соответствующим антигеном, наблюдается их характерная агглютинация. Постановка реакции может осуществляться в пробирках или планшетах.
|
|
|
