 |
Сравнительные методы микробиологической диагностики
|
|
|
|
| Метод | Преимущества | Недостатки |
| Микроскопическое исследование | Простота. Прямое выявление патогенных микроорганизмов. Возможность различения микроорганизмов по морфологическим признакам | Трудоемкость, длительность. Низкая чувствительность. Невозможность различения сходных микроорганизмов. Необходимость высокой квалификации персонала для интерпретации результатов |
| Культивирование in vitro для иммунизации мышей | Обнаружение только жизнеспособных микроорганизмов. Возможность определения вирулентности и инфекционности. | Длительность анализа, высокая стоимость. Разные линии животных дают разные ответы. Потеря жизнеспособности в организме животного. Использование животных |
| Иммунохимические методы | Простота, непродолжительность анализа. Возможность автоматизации. Возможность тестирования большого числа образцов. | Не всегда специфичен. Невозможность разграничения острой и латентной форм инфекции |
| Полимеразная цепная реакция – ПЦР | Простота, быстрота, высокие чувствительность и специфичность. Прямое обнаружение ДНК возбудителя. Возможность различения разных видов патогенов. Независимость результатов от предыдущих инфекций. Не требует жизнеспособности патогенов. Возможность автоматизации | Невозможность различить живые и мертвые микроорганизмы. Возможность получения ложноположительных результатов |
Для проведения микробиологического контроля могут применяться различные методики. В общем виде методы проверки могут быть сведены к некоторым обязательным моментам.
Использование животных- «индикаторов» с известным микробиологическим статусом. Животных помещают в ту же окружающую среду, в которой находится проверяемая популяция, и периодически их умерщвляют и обследуют. Голые (атимичные) мыши являются прекрасными индикаторами, поскольку у них присутствует иммунодефицит и они особенно подвержены воздействию патогенов. Но данные мыши не подходят для обнаружения изменений в серологическом титре, который может указывать на наличие вирусов, поскольку антигенный ответ у голых мышей отсутствует. Для определения серологического титра необходимо использовать животных с соответствующим иммунным статусом.
|
|
|
Выборка животных из популяции колонии для проведения лабораторных исследований. Это – общее посмертное, микробиологическое и гистологическое обследование, выявление паразитов, и т.д. Степень и детальность проводимой проверки зависит от величины расходов вида и качества оборудования. Частота проведения проверок и количество животных, используемых в ходе нее, зависят от многих факторов; шансы обнаружить инфекцию зависят от количества проверенных животных по отношению к общему количеству особей в колонии (в процентном выражении), а также от степени распространения инфекции среди животных.
Плановая проверка животных, которые умерли или были умерщвлены, включая особей, использовавшихся для экспериментов. Такая проверка позволит обнаружить инфекции или повреждения, угрожающие здоровью колонии и качеству, проводимых экспериментов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических участков молекулы ДНК. Их амплификация – иногда в миллионы раз – осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса. Для ПЦР необходимы: 1) два синтетических олигонуклеотидных праймера, комплементарные соответствующим участкам ДНК-мишени; 2) ДНК-мишень длиной от 100 до ~35000 пар нуклеотидов; 3) термостабильный фермент ДНК-полимераза, который осуществляет синтез новой цепи ДНК; 4) четыре дезоксирибонуклеотида.
|
|
|
Типичная ПЦР-амплификация состоит в многократном повторении из следующих трех реакций. Денатурация. Образец ДНК выдерживают при температуре 95оС в течение, по крайней мере, 1мин. Помимо ДНК, в реакционной смеси содержатся в избытке два праймера, термостабильная ДНК-полимераза и четыре дезоксирибонуклеотида. Отжиг. Температуру смеси медленно понижают до ~55оС, при этом праймеры спариваются с комплементарными последовательностями ДНК-мишени. Синтез. Температуру повышают до ~72оС – величины, оптимальной для работы ДНК-полимеразы. Начинается синтез новой комплементарной цепи ДНК, инициируемый праймерами. Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат (амплификатор). Смена температурного режима и его поддержание осуществляются автоматически. Каждый цикл длится 3-5 мин.
При диагностике различных заболеваний метод ПЦР все чаще используется наряду с такими традиционными методами, как бактериологический и иммунохимический, особенно в таких областях клинической диагностики, как: ранняя диагностика вирусных и бактериальных инфекций (в т.ч. хламидиоза, лептоспироза, листериоза, бруцеллеза, лейкоза); диагностика трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных микроорганизмов; диагностика хронических и латентных инфекций; идентификация возбудителей с высокой антигенной изменчивостью; идентификация внутриклеточных паразитов (в т.ч. возбудителя токсоплазмоза).
В последние годы ПЦР активно вытесняется современными протеомными, геномными и нанотехнологическими подходами и методами. Они, несомненно, дают меньше ложноположительных откликов, но ограничиваются высокой стоимостью оборудования и реактивов.
|
|
|
