 |
46. Реакция преципитации и ее варианты.
|
|
|
|
РТГА
Одной из простейших серологических реакции является реакция торможения гемаглютинации. Она основана на том, что АТ при встрече с гомологичным АГ нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, т. к. блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс «АГ+АТ». Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия АТ сыворотки и вируса. РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства двух вирусов. Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток РТГА: возможна только с гемагглютинирующими вирусами.
Принцип титрования АТ в РТГА состоит в следующем:
готовят ряд последовательных (обычно 2-х кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0, 25 или 0, 2 мл);
к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ;
смеси выдерживают определенное время при определенной температуре, ко всем смесям добавляют равные объемы 1-% суспензии отмытых эритроцитов;
после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.
|
|
|
46. Реакция преципитации и ее варианты.
РПГ
— метод выявления антигенов и антител, основанный на диффузии компонентов через слой агарового (агарозного) геля и образования видимого преципитата на участках, где создаются их эквивалентные концентрации.
Чаще всего используется метод двойной (встречной) диффузии, предложенный О. Ухтерлони в 1948 г., при котором антигены и сыворотки вносятся в противостоящие лунки, вырезанные в пластинке геля; через определенное время в толще геля образуются преципитационные полосы, соответственно числу антигенов и антител совпадающей специфичности. Кроме того, метод позволяет проводить сравнение нескольких антигенов между собой при некой стандартной сыворотке: в случае их идентичности образуемые ими полосы преципитации сливаются в сплошную линию и, наоборот, полосы пересекаются, если сравниваемые антигены имеют различия (т. н. феномен “шпоры”). Другим преимуществом РПГ является то, что смеси антигенов могут разделяться за счет разной скорости диффузии и выявляться индивидуально; по этой же причине могут отделяться и ингибиторы преципитации, если они содержатся в испытуемом материале. Недостатком метода считают его низкую чувствительность, иначе, разрешающую способность. РПГ широко использовалась как тест на обнаружение антигенов вируса гепатита В и антител к ним в 60 — 70-е годы, в частности, с помощью этой реакции было установлено наличие в составе вируса е-антигена или HBeAg.
Реакция преципитации характеризуется осаждением специфических мелкодисперсных антигенов эквивалентным количеством антител в присутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса антиген — антитело в виде осадка наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингредиентов. Образовавшийся комплекс может раствориться в избытке антигена или антител. Антиген должен иметь характер прозрачного коллоидного раствора.
|
|
|
В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний реакция преципитации служит главным образом для выявления или идентификации антигена (преципитиногена) по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела (преципитины). Для приготовления коллоидных антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные методы их экстракции из исследуемого материала: физические, химические и биологические.
Реакция преципитации. Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды и чистых культур бактерий. Один из распространенных методов химической экстракции антигенов бактерий — получение комплексного антигена по Буавену с помощью гидролиза бактерий трихлоруксусной кислотой. В реакции используются прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата — помутнения.
Реакция кольцепреципитации. Ставится в узких пробирках (диаметр 0, 5 см), в которые вносят по 0, 2-0, 3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно, по стенке, держа пробирку в наклонном положении, наслаивают 0, 1-0, 2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Результаты опыта протоколируют.
Учет реакции производят через 1—2 мин. В случае положительной реакции в первой пробирке на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В остальных (контрольных) пробирках преципитат не образуется.
Реакция преципитации в геле (агаре). Чашки заливают агаром, в котором вырезают несколько луночек на равном расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят сыворотку, содержащую антитела, в остальные — различные испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях. При диффузии реагентов в агаре в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и антител образуются мутные полосы —дуги преципитации.
|
|
|
В случае постановки реакции преципитации с различными разведениями антигена можно установить титр преципитиру-ющей сыворотки—максимальное разведение антигена, которое дает преципитацию с данной сывороткой. Одна из разновидностей реакции преципитации в геле позволяет определять токсигенность исследуемых бактерий (например, дифтерийной палочки) с помощью антитоксической сыворотки. Для этого в чашку Петри на питательную среду помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Затем чашку подсушивают в термостате и засевают испытуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги, на расстоянии 0, 6-0, 8 см от ее края. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. Чашки инкубируют при 37°С в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации в виде дуг.
Иммуноэлектрофорез. Исследование проводится в два этапа: 1) электрофоретическое разделение исследуемого материала в агаре; 2) иммунологический анализ. В агаре параллельно оси миграции электрофоретических фракций вырезают траншеи, в которые вносят иммунную сыворотку, содержащую антитела к исследуемым антигенам. В случае реакции между антигенами и диффундирующими в агар антителами формируется преципитат в виде дискретных дуг, соответствующих индивидуальным системам антиген—антитело
Иммунофлюоресцентный метод. На предметном стекле готовят мазок из испражнений больного ко-лиэнтеритом, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной сывороткой, содержащей антитела к возбудителям колиэнтерита. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37°С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия — удаляют несвязавшиеся с антигеном антитела. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку, выдерживают в течение 15 мин при 37°С и препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.
|
|
|
