 |
Методы выделения. Хроматографическое определение. Качественное определение. Количественное определение
|
|
|
|
Методы выделения
Для выделения кумаринов из растительного сырья используют преимущественно органические растворители: этиловый спирт, хлороформ, диэтиловый эфир и др.
Наиболее исчерпывающая экстракция кумаринов, как свободных так и гликозидов, достигается этиловым спиртом. Экстракция этиловым спиртом проводится как на холоду так и при нагревании. Получаемый при отгоне спирта густой экстракт чаще всего последовательно обрабатывается хлороформом, диэтиловым эфиром, петролейным эфиром.
В дальнейшем, исходя из растительного материала, характера сопутствующих веществ, структуры самих кумаринов применяются различные частные методы очистки и выделения индивидуальных веществ. На них мы не будем останавливаться, а необходимо знать, что как для очистки кумаринов от сопутствующих веществ, так и для выделения индивидуальных соединений широко применяются хроматографические методы, позволяющие легко и надежно достигнуть разделения кумаринов на индивидуальные вещества.
В качестве сорбента при хроматографировании кумаринов чаще всего используются окись алюминия и силикагель. Кумарины хорошо элюируются из колонки бензолом или смесью бензола с этилацетатом, а также другими растворителями в различных соотношениях.
Кумарины, содержащие фенольные или спиртовые гидроксильные группы, сильнее адсорбируются на окиси алюминия. Адсорбционное сродство кумаринов по отношению к окиси алюминия усиливается с увеличением числа гидроксильных групп. Эти соединения элюируются большим объемом полярных растворителей, подобных спирту.
В тех случаях, когда в смеси находятся кумарины, обладающие одинаковым адсорбционным сродством по отношению к окиси алюминия, приходится проводить многократное хроматографирование для их разделения.
|
|
|
С целью подбора наилучших условий разделения, неизвестной смеси кумаринов следует проводить предварительное хроматографирование небольшого количества экстракта с предварительным его изучением методом бумажной или тонкослойной хроматографии, позволяющих быстро установить однородность исследуемых веществ и обнаружить даже незначительные их количества.
Хроматографическое определение
Для обнаружения кумаринов в растениях и сырье используются лактоновые свойства кумаринов, их способность флуоресцировать при ультрафиолетовом освещении и давать окрашенные растворы со специальными реактивами, микросублимацию и хроматографический анализ экстрактов сырья.
На пластинку " Силуфол" или хроматографическую бумагу наносят исследуемые экстракты и помещают в хроматографическую камеру с системой, указанной в НД на исследуемое сырье. Хроматограммы после высушивания просматривают в УФ-свете. Флуоресцирующие пятна кумаринов отмечают простым карандашом и хроматограммы обрабатывают щелочью. После этого их высушивают в сушильном шкафу при t=120°С и вновь просматривают в УФ-свете. Затем хроматограмму обрабатывают диазотированным сульфаниламидом, от действия которого кумарины в зависимости от структуры окрашиваются в оранжевый, красно-оранжевый, фиолетовый цвета.
В некоторых случаях после просматривания хроматограммы в УФ-свете ее обрабатывают реактивом Драгендорфа (BiI3 в KI) или парами иода. Кумарины проявляются в виде пятен, окрашенных в коричневый цвет.
Качественное определение
Около 2 г измельченного сырья (плоды амми большой, пастернака посевного, корни горичника, трава донника и др. ) заливают 20 мл. этилового спирта и кипятят в течение 15 мин на водяной бане с обратным холодильником. Извлечение охлаждают и фильтруют, далее проводят качественные реакции.
|
|
|
1. К 3-5 мл спиртового извлечения в пробирке прибавляют 10 капель 10% раствора КОН в метиловом спирте и нагревают в течение 5 мин. на кипящей водяной бане (при наличии кумаринов раствор желтеет). В пробирку прибавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива (диазотированная сульфаниловая кислота). При наличие кумаринов раствор приобретает окрашивание от коричнево-красного до вишневого.
2. К 3-5 мл спиртового извлечения добавляют 10 капель 10% спиртового раствора КОН и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Затем добавляют 5-10 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают и добавляют по каплям 10% раствор соляной кислоты до кислой реакции. При наличии кумаринов в сырье наблюдается помутнение или выпадение осадка в зависимости от содержания кумаринов (лактонная проба).
Количественное определение
В основу количественного определения кумаринов берется то или иное специфическое свойство кумаринов.
1) Способность лактонного кольца кумарина к обратимому замыканию и размыканию в зависимости от рН среды используется в гравиметрическом методе определения суммы кумаринов в растительном сырье.
2) Специфическое отношение кумаринов к щелочи лежит в основе метода нейтрализации (обратное титрование), которое применяется как для определения суммы кумаринов, так и для индивидуальных компонентов.
3) Хорошо разработаны колориметрические методы количественного определения как кумарина, так и суммы его производных в растениях. В основе этих методов лежит способность кумаринов давать устойчивые красно-пурпуровые растворы с диазотированным п-нитроанилином и сульфаниловой кислотой в щелочной среде.
Калибровочная прямая строится по одному из известных соединений.
Для количественного определения кумаринов применяются спектрофотометрические методы. В основу этих методов положено изменение оптической плотности растворов кумаринов при длине волны максимума поглощения в УФ-области того или иного кумарина в зависимости от концентрации на основе удельных показателей поглощения. Если колориметрическим и спектрофотометрическим методам предшествует хроматографическое разделение на бумаге или слое сорбента, методы называются хроматоколориметрическими и хроматоспектрофотометрическими соответственно.
Количественное определение кумаринов проводят также флуориметрическим и полярографическим методами. Последний применяется для анализа готовых лекарственных форм, содержащих фуранокумарины.
|
|
|
