 |
Методы ускоренной диагностики холеры.
|
|
|
|
А. Иммунофлуоресцентный.
Рисунок 6.
Мазки обрабатывают люминесцентной сывороткой и рассматривают в люминесцентном микроскопе. При наличии в исследуемом материале холерного вибриона в первом мазке произойдет свечение вибрионов, во втором - свечение отсутствует.
2. Реакция пассивной гемагглютинации.
Для обнаружения холерных вибрионов в содержимом кишечника используют антителъный диагностикум, т.е. эритроциты, на которых предварительно адсорбируют соответствующе антитела. Реакцию ставят по обычной методике. При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов происходит агглютинация эритроцитов.
Б. Серологический.
Для серологической диагностики холеры можно использовать реакцию агглютинации, реакцию обнаружения копроантител и реакцию определения титра вибриоцидных антител (бактериолизинов).
Реакцию агглютинации ставят по обычной методике с сывороткой больного, инактивированной нагреванием. В качестве антигена используют 5-часовую агаровую культуру холерного вибриона штамма Огава и отдельно штамма Инаба. Антитела в крови больного появляется с 5-го дня от начала заболевания. Реакция считается положительной при титре сыворотки 1:40 и выше.
0-агглютинины у больных и вибрионосителей можно определить также в инактивированной сыворотке, разведенной 1%-ной пептонной водой от 1:10 до 1:1280 в объеме 1 мл. В пробирки вносят по 0,1 мл 3-часовой бульонной культуры холерных вибрионов. После 2 часов инкубирования при 37° и выдерживания на холоде в течение ночи учитывают результат.
Для определения титра вибриоцидных антител (бактериолизинов) инактивированную сыворотку больного разводят на холоде в растворе комплемента 1:20 в объеме 0,45 мл от 1:10 до 100000. В качестве комплемента использует сыворотку морской свинки, проверенную на отсутствие естественных бактериолизинов. К каждому разведению сыворотки добавляют 0,05 мл суточной агаровой культуры холерных вибрионов с концентрацией 20000 микробных тел в 1 мл. Контролями служат пробирка, в которой отсутствует сыворотка, и пробирка, в которой отсутствует комплемент. Все пробирки инкубируют при 37º в течение 1 часа, затем помещают на холод и микропипеткой высевают по 0,05 мл из каждой пробирки на чашки с питательным агаром. Чашки помещают в термостат и инкубируют при 37°. Через 24 часа подсчитывают количество колоний, выросших на чашках с посевами из опытных и контрольных пробивок. За титр вибриоцидных антител (бактериолизинов) принимают то максимальное разведение сыворотки, при высеве из которого вырастает в 2 раза меньше колоний, чем при высеве из контрольных пробирок.
|
|
|
По аналогичной методике можно определить содержание вибриоцидных антител и в фильтрате содержимого кишечника (испражнений) больного холерой.
Можно определить титр вибриоцидных антител и без предварительной инактивации комплемента и без добавления стандартного комплемента. Исследуемую сыворотку в этом случае наносят каплями (в соответствующем разведении) на чашку с питательной средой, на которую предварительно наносят каплю свежей культуры и рассевают её по всей поверхности среды с помощью шпателя. На месте нанесения капель сыворотки, в которых еще содержатся вибриоцидные антитела и комплемент в достаточном количестве, чтобы вызвать лизис вибриона, роста его не будет ("стерильные пятна").
Для обнаружения антител к холерогену (антитоксинов) в настоящее время применяются иммунофлуоресцентный и иммуноферментный методы.
Кроме того, для обнаружения гена, контролирующего синтез холерогена, разработан метод ДНК-зонда.
|
|
|
Контрольные вопросы.
Каковы морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические особенности холерного вибриона?
Каково антигенное строение холерного вибриона?
По каким признакам отличают семейство Vibrionaceae от семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae?
По каким признакам отличают род Vibrio от родов Aeromonas, PLesiomonas?
По каким признакам отличают холерный вибрион от холероподобных?
Какие существуют биотипы холерного вибриона?
Как происходит заражение при холере?
Где в организме больного локализуется холерный вибрион?
Какие микробиологические методы применяют для диагностики холеры?
Какой материал берут от больного для исследования?
Какой трупный материал подвергают исследованию?
Какие правила следует соблюдать при взятии, пересылке и исследовании материала при подозрении на холеру?
Какие питательные среды применяют для выделения холерного вибриона?
Как выделяют чистую культуру холерного вибриона?
На основании каких признаков идентифицируют холерный вибрион?
Какова сущность иммунофлуоресцентного метода ускоренного обнаружения холерного вибриона?
По каким признакам отличают классический вибрион от вибриона Эль Тор?
Какие токсины образует холерный вибрион? Какое действие оказывает энтеротоксин (холероген) на организм человека?
В чем заключается принцип патогенетического лечения больных холерой?
Как ставят пробу со специфическими холерными монофагами?
В чем заключается биологический метод определения энтеротоксигенности (холерогенности) вибрионов?
Какие серотипы различают у холерных вибрионов?
Какие основные биологические свойства парагемолитических вибрионов? Как происходит заражение ими и какие они вызывают заболевания?
Какое основное отличие галофильных вибрионов от холерных и холероподобных?
Какие метода обнаружения холерогена Вы знаете?
Какова природа и структура холерного энтеротоксина (холерогена)?
Каковы косвенные доказательства отсутствия токсигенных свойств у холерного вибриона?
Какими функциями обладают фрагменты А и В холерогена?
С чем связана способность некоторых холероподобных вибрионов вызывать холероподобные диареи?
Каким образом идентифицируют холероподобные, т.е. не относящиеся к 01-группе, вибрионы?
|
|
|
Приложение к занятию 9.
Возбудитель холеры относится к семейству Vibrionaceae, которое включает в себя несколько родов, в том числе роды: Vibrio, Аеromonas, Plesiomonas.
К роду vibrio относятся грамотрицательные, не образующие спор и капсул палочки, с одним изгибом или прямые, с одним полярно расположенным жгутиком, индофенолоксидазоположительные, образующие кислоту без газа из d-глюкозы путем гликолиза по схеме Эмбден-Мейергофа (до молочной кислоты), имеющие декарбоксилазы лизина и орнитина, лишенные аргининдигидролазы, разжижающие желатину, восстанавливающие нитраты в нитриты и не образующие сероводорода.
Представители рода Aeromonas имеют аргининдигидролазу. Представители рода Plesiomonas имеют все три фермента: лизин- и орнитин-декарбоксилазы и аргининдигидролазу.
Род Vibrio включает следующие виды: V.cholerae, V.parahaemolyticus, V.anguillarum, V.fisheri, V.costicola.
С 1985 года в этот род включено уже более 20 видов.
Вид V.choleгае разделяют на следующие биовары: Vibrio cholerae (в том числе V.eltor), имеющий 01-антиген; V.fincler-prior - включает все холероподобные вибрионы, не относящиеся к 01-серологической группе. По О-антигену холероподобные (НАГ-) вибрионы разделяются на несколько десятков серогрупп. Могут вызывать холероподобные диареи. Вибрионы этих серогрупп идентифицируют с помощью соответствующих О-сывороток.
|
|
|
