 |
Методы микробиологической диагностики газовой гангрены.
|
|
|
|
Бактериологический.
Исследование проб на наличие патогенных клостридий.
Исследуемый материал.
| Посев на среды: | Посев по 1 мл в жидкие питательные среды - мясные или казеиновые (5 пробирок): 1-я пробирка - непрогретая, 2-я - прогрев при 80° - 15 минут, 3-я - прогрев при 100º - 5 минут, 4-я - прогрев при 100º - 10 минут, 5-я - прогрев при 100º - 20 минут. Инкубация при 37º 1-15 суток. | ||||
| в чашках | в пробирке | ||||
| Кровяной МПА | Среда Виллиса-Хоббс | Среда Вильсон-Блера | |||
| Анаэробные условия | |||||
| Инкубация при 37ºС 1-7 суток | |||||
| Микроскопия, изоляция и пересев на мясную или казеиновую среду колоний, вызывающих гемолиз, опалесценцию или почернение на одной из указанных выше сред и состоящих из грамположительных палочек. | Выросшие культуры, содержащие массу грамположительных палочек, подвергают дальнейшему изучению. | ||||
| Изучение свойств выделенных культур. | Проверка токсичности фильтратов или центрифугатов на мышах или морских свинках. | Посев на плотные питательные среды: чашки с кровяным МПА, со средой Виллиса-Хоббс, с бензидиновым МПА, столбик агара Вильсон-Блера. | |||
| Реакция нейтрализации с сыворотками: C.perfringens типа А, С. novyiтипа А, В, C. septicum, C. sordellii, C.histolyticum. | Инкубация при 37° 1-4 суток. Изоляция колоний, вызывающих гемолиз, опалесценцию или почернение на питательных средах. Изучение свойств выделенных культур. | ||||
Б. Биологический.
Для обнаружения токсина и его типа в реакции нейтрализации.
Для обнаружения токсина двум мышам вводят исследуемый фильтрат в количестве 0,5 мл внутрибрюшинно, другим двум мышам вводят смесь, состоящую из 0,5 мл фильтрата и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток типа А,В,С,Е (соединяют по 0,5 мл сыворотки каждого типа). Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Наблюдение за животными ведут в течение 4 дней. При наличии токсина погибают первые две мыши, остальные остаются живы.
|
|
|
Рисунок 3. Ускоренный метод обнаружения C.perfringens.
Одна пробирка каждой среды после внесения материала прогревается при 80°С 20 минут.
Почернение среды Вильсон-Блера в течение 3-х часов и бурное створаживание молока в течение 6 часов характерны для C.perfringens.
При обнаружении токсина ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина. Для этого в 5 пробирок разливают по 2,4 мл испытуемого фильтрата и в каждую пробирку прибавляют по 0,6 мл сыворотки раздельно типа А, типа B, типа С и типа Е. В 5-ю пробирку прибавляют 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутрибрюшинно по 1 мл 2 мышам из каждой пробирки отдельными шприцами. Наблюдают за животными в течение 4 дней. При наличии токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, остальные мыши гибнут. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.
В. Ускоренные методы диагностики ботулизма:
а) обнаружение токсина с помощью РПГА (на эритроцитах адсорбируют антитоксин)
б) обнаружение токсина с помощью реакции угнетения фагоцитоза. Ботулинический токсин резко угнетает фагоцитарную способность лейкоцитов в связи с наличием у токсина лейкотоксических свойств. При этом фагоцитарный показатель уменьшается в 3,5, 10 и даже 20 раз. При добавлении к крови, содержащей токсин, гомологичной антитоксической сыворотки фагоцитарная способность лейкоцитов восстанавливается.
Контрольные вопросы.
Каковы основные биологические свойства анаэробных бактерий?
|
|
|
Какова роль анаэробных бактерий в патологии человека?
Какие заболевания вызывают анаэробные бактерии?
Каков механизм заражения при газовой гангрене?
Что является средой обитания анаэробных бактерий в естественных условиях?
Какие возбудители чаще всего вызывают газовую гангрену?
Какие токсины образуют возбудители газовой гангрены и на что они действуют?
Каковы особенности патогенеза газовой гангрены?
Какие условия способствуют развитию газовой гангрены?
По каким основным признакам различаются между собой c.perfringens, C.novyi, C.septicum, C.histolyticum?
Какие ускоренные методы применяются для обнаружения c.perfringens?
Какие микробиологические методы используются для диагностики анаэробных инфекций?
Каковы основные морфологические, культуральные и биохимические особенности возбудителя столбняка?
Какова природа токсина столбнячной палочки и на что он действует?
Чем отличается картина столбняка у человека и у мелких лабораторных животных?
Что является средой обитания для столбнячной палочки?
Чем объясняется высокая обсемененность почвы столбнячной палочкой в Краснодарском крае?
Каковы основные морфологические и биологические свойства возбудителя ботулизма?
Какова природа токсина палочки ботулизма? Какие типы токсина продуцирует возбудитель и что поражает токсин?
Какие условия способствуют размножению возбудителя ботулизма и накоплению токсина в пищевом продукте?
Какой материал берется для исследования при подозрении на ботулизм?
Какие методы применяются для обнаружения токсина возбудителя ботулизма и определения его типа?
Какие продукты чаще всего являются причиной отравления при ботулизме?
Как осуществляется специфическая профилактика и лечение ботулизма? Какие препараты применяются для этой цели?
Что представляет собой прототоксин?
Какова природа и структура столбнячного токсина?
Как активируется столбнячный токсин?
Что поражает столбнячный токсин?
Каковы функции тяжелой и легкой цепей столбнячного токсина?
Как продвигается столбнячный токсин к ядрам двигательных нервов?
Каков защитный уровень антитоксина против столбнячного токсина?
Как осуществляется специфическое лечение и специфическая профилактика столбняка?
|
|
|
Как обеспечивается формирование коллективного иммунитета против столбняка и какие препараты применяют для этой цели?
Что такое прогенитарные токсические комплексы, образуемые палочкой ботулизма?
Какие структурные варианты прогенитарных токсических комплексов Вы знаете? Каков их состав?
Как происходит активация ботулинического токсина?
Какая разница между протеолитическими и непротеолитическими вариантами возбудителя ботулизма? Каким образом осуществляется у них активация токсина?
В чем заключается механизм активации ботулинического токсина?
Какие функции выполняют нетоксические белки в составе белковых комплексов?
Каковы физико-химические свойства токсина ботулизма? Какие токсины, кроме нейротоксина, образует возбудитель ботулизма?
Ботулизм - интоксикация или токсикоинфекция?
Что поражает ботулинический токсин?
Какой синдром чаще всего наблюдается у больных ботулизмов?
ЗАНЯТИЕ 12.
Дата_______
Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ АНАЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ
(окончание).
План занятия.
A. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций.
Регистрация результатов посева материала, содержащего анаэробные микробы, макро- и микроскопия выросших культур.
Б. Микробиологический диагноз дифтерии.
1. Изучение морфологии и культуральных свойств дифтерийной палочки. Макро- и микроскопия культур бактерий.
2. Типы дифтерийных бактерий. Демонстрация роста культур соответствующих типов на теллуритовых средах и их биохимических свойств.
3. Биохимические свойства коринебактерий. Дифференциация истинных дифтерийных бактерий от псевдодифтерийных и дифтероидов по биохимическим свойствам. Демонстрация и разбор.
4. Правила взятия и пересылки материала от больного дифтерией для бактериологического исследования. Разбор.
5. Бактериологическая диагностика дифтерии. Исследование дифтеритической пленки (или материала от бактерионосителя). Посев на теллуритовые среды.
6. Определение токсигенности дифтерийных бактерий методом преципитации в агаре и биопробой на морской свинке. Разбор и демонстрация.
|
|
|
B. Ми-кробиологический диагноз коклюша.
Изучение морфологии и культуральных свойств коклюшной палочки.
Микробиологическая диагностика коклюша. Разбор схемы.
Г. Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для профилактики и лечения дифтерии и коклюша.
Методические указания.
А. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций.
1. Зарегистрировать результаты посева материала, содержащего анаэробные микроорганизмы. Приготовить препарат-мазок, окрасить по Граму и зарисовать.
Б. Микробиологический диагноз дифтерии.
§1. Готовые фиксированные мазки из чистой культуры дифтерийной палочки окрасить синькой Леффлера и по Нейссеру. Дифтерийные бактерии окрашиваются неравномерно, более интенсивно окрашиваются зерна волютина. При окраске метиленовым синим.наблюдается явление метахромазии. По способу Нейссера зерна окрашиваются в темно-коричневый цвет. Дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу в виде римской цифры V. Препараты промикроскопировать и зарисовать.
Знакомство с характером роста возбудителя дифтерии на свернутой сыворотке, на таллуритовых средах.
§2. Демонстрация роста различных типов дифтерийной палочки на теллуритовой среде. Разбор биохимических свойств различных типов дифтерийной палочки по демонстрационным наборам.
§3. Знакомство с биохимическими свойствами дифтерийной палочки по биохимическим наборам. Демонстрация и разбор. Заполнить таблицу.
§ 4. Исследованию подвергаются слизь или пленка из зева, носа, носоглотки, миндалин. Реже исследуется материал с конъюнктивы глаза, со слизистой оболочки половых органов или с поверхности ран. Материал берут стерильным тампоном. Тампон погружают в стерильную пробирку с этикеткой, на которой указаны фамилия, имя, отчество, возраст больного и из какого места (полости) взят материал. Пробирки с материалом помещают в металлические пеналы и с нарочным отправляют в лабораторию для доследования. Разбор методики взятия материала из зева, носа и других мест и посева его при дифтерии.
§5. С помощью стерильного ватного тампона произвести друг у друга забор материала со слизистой зева или носа и сделать посев на сывороточную среду с теллуритом.
§6. Методика определения токсигенных свойств возбудителя дифтерии преципитацией в агаре заключается в следующем. Полоски фильтровальной бумаги размером 1,5x8 см, простерилизованные в автоклаве, смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, разведенной стерильным физиологическим раствором до содержания 500 АЕ в 1 мл. Смоченную сывороткой бумажку стерильным пинцетом переносят на поверхность питательной среды в чашку Петри. Чашку подсушивают в термостате 15-20 минут. Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от фильтровальной бумажки. На одну чашку засевают несколько штаммов, один из которых заведомо токсигенный и служит контролем. Чашки с посевом помещают в термостат при температуре 37°С. Результат учитывают в течение 48 часов. В месте взаимодействия антитоксина с токсином образуется линия преципитации. Если исследуемая культура образует токсин, то ее линия преципитации сливается с линией преципитации контрольного штамма, образуя сплошную белую полоску. При неспецифической преципитации линия, образуемая исследуемым штаммом, пересекает или имеет тенденцию к пересечению с линией контрольного штамма.
|
|
|
Демонстрация чашек с культурами токсигенной и нетоксигенной дифтерийной палочки. Зарисовать схему определения токсигенных свойств возбудителя дифтерии.
Определить токсигенные свойства дифтерийной палочки можно также методом биопробы. Для опыта берут двух морских свинок, накануне одной из них вводят 500-1000 АЕ антитоксической противодифтерийной сыворотки. Затем свинкам вводят подкожно (0,2 мл) или внутрикожно (0,1 мл) исследуемую культуру. Если испытуемая культура токсигенна, то при подкожном введении опытная свинка через 2-5 дней погибает. При вскрытии обнаруживается отек в месте введения культуры, экссудат в брюшной и грудной полостях и в перикарде. Особенно характерным симптомом является увеличение и гиперемия надпочечников. Контрольная свинка остается живой. При внутрикожном введении токсигенной культуры у опытной свинки в месте инъекции наблюдается покраснение, отечность, а в дальнейшем - некроз. У контрольной морской свинки никаких изменений не отмечается.
В. Микробиологический диагноз коклюша.
§1. Промикроскопировать готовые препараты-мазки из культуры коклюшной палочки с окраской по Граму и зарисовать.
Ознакомиться с ростом коклюшной и паракоклюшной палочек на средах Борде-Жангу, казеиново-угольной и средах "пестрого ряда". Демонстрация.
§2. Разбор методов микробиологической диагностики коклюша: бактериологического и серологического. Дифференциация коклюшной и паракоклюшной палочек.
Г. Знакомство с иммунопрепаратами: адсорбированный дифтерийный анатоксин, дифтерийный токсин для реакции Шика, противодифтерийная сыворотка, адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин, адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина и др.
|
|
|
