 |
Получение первичных культур. Примеры суспензионных и прикрепленных культур, которые могут быть использованы в терапии.
|
|
|
|
Принципы разработки сред для культивирования клеток. Бессывороточные среды и среды определенного химического состава.
После извлечения клеток из ткани или организма и помещения их в культуру культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это обеспечивает выживание клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Внеклеточная среда должна обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, т.е. обладать всем необходимым для роста и выживания клеток. Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты невыясненного биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т.д.). Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотно-щелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство рН среды является одним из главных требований условий культивирования.
Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса.
• Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) (Осмоляльность, мосмоль/кг — 271-300) – мало бикарбоната!
• Буфер Эрла (Earle’s Balanced Salts) (осмоляльность 310.6 мосмоль/кг, реальная 283) –
много бикарбоната!
• PBS или DPBS - буфер фосфатный модифицированный Дульбекко pH 7,4
NaCl 137mM, KCl 2,7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 1,76mM
С/без кальция и магния
Другим важным условием культивирования является осмотическое давлении. Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Для поддержания рН в большинстве сред используется бикарбонатный буфер: HCO3 = CO2 + OH, если выделяется углекислый газ, увеличивается концентрация ОН. Растворы могут содержать малое количество бикарбонатного буфера (раствор Хенкса), они предназначены для поддержания рН в плотно закрытых сосудах. В других (растворе Эрла) бикарбоната больше, они используются в системах с повышенным парциальным давлением СО2. Если культуры ведутся вне СО2 инкубатора, где рН поддерживать труднее, необходимы альтернативные буферные системы. Хорошим буфером является HEPES 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислота
|
|
|
Основные компоненты культуральной среды:
1) Компоненты, обеспечивающие буферную систему культуральной среды (рН для большинства клеток 7,2-7,4).
Бикарбонат натрия поддерживает «естественную» буферную систему культуральной среды (CO32- /HCO3-); требуя содержания 5-10 % СО2 в атмосфере, что легко выполнимо при культивировании клеток в СО2-инкубаторе.
ХЕПЕС представляет собой фосфатную соль с буферной емкостью в пределах 7,2-7,4 рН. Не требует контролируемой газовой среды, в больших концентрациях может быть токсичен.
Феноловый красный используется как индикатор рН (Для культивирования клеток, чувствительных к эстрогену рекомендуется использовать среду без фенола красного)
Неорганические соли поддерживают осмотическое давление в среде и помогают в регуляции мембранного потенциала, обеспечивая среду ионами натрия, калия и кальция. Оптимальное значение осмоляльности лежит в пределах 260-340 мосмоль/кг в зависимости от типа культивируемых клеток.
2) Аминокислоты L-глутамин; обеспечивает азотом НАД, НАДФН и нуклеотиды, являясь вторичным источником энергии для метаболизма клетки. Заменимые аминокислоты.
|
|
|
3) Углеводы глюкоза, галактоза
4) Белки и пептиды альбумин, трансферрин и фибронектин; альфа2 макроглобулин, особенно важны при бессывороточном культивировании!
5) Жиры и жирные кислоты особенно важны при бессывороточном культивировании!
6) Витамины рибофлавин, тиамин и биотин.
7)Добавки сыворотка; 5-10 %. (альбумины, факторы роста и ингибиторы роста, цитокины, гормоны; является источником витаминов, аминокислот, белков, углеводородов, жиров, микроэлементов, факторов роста).
8)Антибиотики добавляются для предотвращения контаминации культуральной среды бактериями и грибами; однако антибиотики не предотвращают заражение культуральной среды микоплазмой!
Среды:
• Среда MEM (Minimum Essential Medium), среда Игла - содержит 13 аминокислот, 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата
среды МЕМ с солями Эрла и Хэнкса, а также α-модификация среды MEM с содержанием всех 21 аминокислот и солями Эрла. МЕМ используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы.
• Среда BME (Basal Medium Eagle)
• Среда DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) содержит в четыре раза больше аминокислот и витаминов, чем BME, а также различные добавки, улучшающие рост клеток. Есть модификации среды DMEM (с высоким и пониженным содержанием глюкозы, пирувата натрия, различных добавок) для культивирования клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридом. необходим инкубатор с 10% концентрацией СО2.
• Среда DMEM/F-12 в соотношении 1:1 применяется для выращивания широкого спектра клеточных культур. Очень богата питательными веществами.
• Среда RPMI-1640 была разработана в Roswell Park Memorial Institute (изначально - культивирования лейкоцитов).
• Среда IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) - это модификация среды DMEM, содержащая селенит натрия, добавочные аминокислоты и витамины, пируват натрия, ХЕПЕС и нитрат калия вместо нитрата железа. Среда IMDM используется для поддержания культуры клеток В лимфоцитов, В клеток, стимулированных полисахаридами, Т лимфоцитов и гибридом.
• Среда 199 - Используется без добавок, как поддерживающая для первичных клеток, а с сывороткой как ростовая среда для быстро размножающихся клеток. Нормальные, сохраняющие специфические функции клетки на стандартных средах не размножаются (если не трансформированы). Для оптимального роста клеток обычно добавляют 5 - 20% фетальной (эмбриональной) сыворотки.
|
|
|
• Среды F-12 и F-10 изначально были разработаны Хэмом (Ham′s nutrient mixture) для культивирования СНО клеток, HeLa и мышиных L-клеток. Обе среды были разработаны для бессывороточного культивирования. Среда F-12 применяется для культивирования широкого спектра клеток млекопитающих и гибридом.
• Среда Шнейдера (Schneider’s Insect Media) клетки дрозофилы
• Среда Лейбовица
В зависимости от необходимости добавления сыворотки выделяют несколько типов сред:
· Основные (базовые) среды (basal media) (требуют добавления 10% сыворотки)
· Улучшенные среды (advanced media) (требуют добавления 1-5% сыворотки)
· Бессывороточная среда (serum-free medium) (не требуют добавления сыворотки)
Виды сыворотки: 1) эмбриональная бычья сыворотка (Fetal bovine serum, FBS)
2) Сыворотка молодых бычков (BS)
3) Сыворотка новорожденных телят, стерильно отфильтрованная
Базовые клеточные среды: MEM, DMEM, DMEM/F-12 и RPMI 1640
Улучшенные среды: Advanced - MEM, -DMEM, -DMEM/F-12 и - RPMI 1640. Содержат дополнительные питательные вещества и вещества из сыворотки животных: этаноламин, глутатион, аскорбиновую кислоту, инсулин, трансферрин, богатый липидами бычий сывороточный альбумин (AlbuMAX® I), микроэлементы: селенит натрия, метаванадат аммония, сульфат меди и хлорид марганца.
Бессывороточные среды: как правило, разрабатываются для конкретных клеточных линий с учетом их особенностей и потребности в определенных факторах роста - Среды F-12 и F-10
Специальные среды:
- для разработки гибридом:
HT – смесь гипоксантина и тимидина, необходимых для синтеза аминокислот по запасному пути. Используется для культивирования гибридом.
HAT – смесь аминоптерина, гипоксантина и тимидина. Используется для отбора гибридных клеток.
Получение первичных культур. Примеры суспензионных и прикрепленных культур, которые могут быть использованы в терапии.
Первичная культура – это культура клеток на стадии непосредственно после выделения клеток и до первого посева.
|
|
|
4 стадии получения:
1) получение образца;
2) выделение ткани;
3) препарирование и/или дезагрегация;
4) культура после посева в культуральный сосуд.
Для обработки каждой ткани характерна своя последовательность действий, для большинства имеются некоторые общие требования:
1)Жир и некротические ткани лучше всего удалять во время препарирования.
2)Ткань мелко нарезать острым инструментом, чтобы повреждения были минимальными.
3) Ферменты для дезагрегации удаляются с помощью мягкого центрифугирования.
4)Концентрация клеток в первичной культуре должна быть намного выше, чем обычно используемая при субкультивировании, так как процент клеток, которые выживут в первичной культуре, может быть довольно низким.
5)Предпочтительней использовать богатые среды (Хэма F12), а не простые (МЕМ Игла). Если требуется сыворотка, следует учесть, что фетальная бычья сыворотка способствует лучшей выживаемости по сравнению с телячьей или лошадиной. Для выделения специфических типов клеток потребуются селективные среды.
6)Дезагрегация эмбриональных тканей проходит легче, чем тканей взрослого организма, выживает больше клеток, и они быстрее начинают пролиферировать.
Получение образца.
Перед началом работы с тканями животных или человека вы должны быть уверены, что ваша работа соответствует требованиям медицинской этики или современным законодательным нормам в отношении экспериментов с животными.
Требование безопасности. Работа с тканями человека должна выполняться в соответствии с Уровнем защиты 2 в ламинарных шкафах II класса биологической защиты.
Перед работой простерилизовать место резекции 70%-м спиртом (в случае если есть вероятность загрязнения, например на коже). Асептически вырежьте ткань и как можно скорее перенесите ее в лабораторию культуры ткани в BSS (DBSS) или в среде для транспортировки. Если задержка в транспортировке ткани неизбежна, ткань можно хранить при 4 °С до 72 ч, хотя лучший результат достигается при быстрой транспортировке.
Выделение образца ткани.
Переносим образец в чашку Петри со свежим стерильным DBSS и промываем.
На данном этапе получения первичной культуры происходит стерильное удаление нежелательной ткани (жир, некротическая ткань).
|
|
|
