2.5.3. Процедура тестирования

i) Проще всего скринировать сыворотки в разведении 1/20; 0, 25 мл антигена добавляют к 0, 25 мл сыворотки, предварительно разведенной в соотношении 1/10 в физиологическом растворе.

ii) Анализируемый материал инкубируют в водяной бане при 50°C 24 часа для соматических антигенов и 4 часа для жгутиковых антигенов. Разведение и время инкубации варьируются в зависимости от используемых антисывороток.

iii) Затем сыворотки, которые дают положительную реакцию, разбавляют от 1/20 до 1/320 и повторно анализируют с соответствующим антигеном.

2. 6. Твердофазные иммуноферментные анализы для Salmonella Enteritidis

Доступны две основных базовых системы для выявления иммуноглобулина G (иммуноглобулина Y), специфичного для S. Enteritidis: непрямой твердофазный ИФА и конкурентный твердофазный ИФА типа «сэндвич» (Barrow, 1994).

Непрямой твердофазный ИФА включает применение выявляющего антигена, покрывающего лунки микротитрационного планшета. После нанесения блокирующего реактива для уменьшения неспецифического связывания анализируемые образцы вносят в лунки. Специфически связанное антитело в образце выявляют через конъюгат антитело/фермент. Было использовано множество антигенов, включая ЛПС, жгутики, реснички SEF14, белки наружной мембраны и неочищенные препараты цельноклеточного антигена.  

В конкурентном твердофазном ИФА типа «сэндвич» для антигенного покрытия лунок используют специфичный реактив – моноклональное антитело (MA b) или поликлональное антитело. Вслед за этим используется очищенный или неочищенный препарат антигена. Анализируемые образцы вносят в лунки в сопровождении конъюгированного антитела, которое не будет связываться с антигеном при наличии в образце специфичных антител. Время анализа можно сократить, одновременно добавляя как анализируемый образец, так и конъюгат. Моноклональные антитела были получены для ЛПС, жгутиков и ресничек SEF14 S. Enteritidis.

Обе системы имеют как преимущества, так и недостатки. Непрямой анализ проще, кроме того, имеются доступные реактивы для всех сероваров Salmonella, выявленных у кур, индюков, уток и млекопитающих. Конкурентный твердофазный ИФА, который, в целом, демонстрирует более высокую специфичность, можно применять ко всем видам животных. Однако не для всех сероваров имеются коммерчески доступные реактивы. Также имеются некоторые проблемы аффинности, и этот метод менее чувствителен, чем непрямой анализ. В полевых условиях обе системы давали ложноположительные реакции, а в некоторых случаях скрининг непрямым твердофазным ИФА и ЛПС сопровождается подтверждением по методу конкурентного твердофазного ИФА со жгутиковым антигеном. Эту комбинацию использовали для дифференциации полевой инфекции, вызванной S. Enteritidis, от иммунной реакции на вакцину Gallinarum 9R, которая характеризуется отсутствием жгутиковых антигенов.

Оба типа анализов используют на материале сыворотки, яичного желтка или восстановленной высушенной крови, элюированной с дисков фильтровальной бумаги. В Дании и других странах микс-твердофазный ИФА (или твердофазный ИФА с мясным соком) используют для выявления инфекции Salmonella у свиней (Nielsen et al. , 1998). Этот твердофазный ИФА содержит ЛПС антигены «O» 1, 4, 5, 6, 7 и 12 от S. Typhimurium и S. Choleraesuis, что позволяет ему серологически выявить до 95% серогрупп Salmonella, обнаруженных у свиней в большинстве европейских стран. К некоторым наборам для твердофазного ИФА также были добавлены антигены группы D. Для

скрининга воспроизводящегося и размножающегося поголовья используют сыворотку, а для свиней на скотобойне, анализ обычно проводят на тканевой жидкости или «мясном соке», который высвобождается при оттаивании замороженного 10-граммового образца мышц.

Некоторые варианты твердофазного ИФА позволяют провести дифференциацию между инфекциями, вызванными сероварами Salmonella из разных серогрупп. Наблюдается некоторая перекрестная реакция между группами B и D и другими инвазивными сероварами. Однако если в твердофазном ИФА используется ЛПС антиген от гомологичного серовара, то, как правило, наблюдается больший ответ антител. До сих пор не был разработан и согласован на международном уровне оптимальный метод выбора «отсечки» для величины поглощения, выше которой сыворотки можно определить как материал из стада, инфицированного S. Enteritidis, не порождая при этом недопустимого уровня ложноположительных результатов.

Твердофазный можно легко адаптировать к технологии автоматизации, то есть, использовать в крупномасштабных программах тестирования. Основная проблема заключается в том, что необходимы дорогое оборудование, и многие дорогие реактивы. Доступно несколько коммерческих наборов твердофазного ИФА для S. Enteritidis, S. Typhimurium и микс-твердофазного ИФА группы B/C. В идеале они должны пройти аттестацию в международных круговых исследованиях перед практическим применением в целях наблюдения.

В качестве примера аттестованного твердофазного ИФА можно привести метод, разработанный в референтной лаборатории МЭБ, A PHA, Вейбридж (адрес см. в таблице, приведенной в 4 части данного Руководства МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных). Требования приведены ниже.