 |
2. 6. 1. Оборудование. 2. 6. 2. Антиген. 2. 6. 3. Разбавитель сыворотки и конъюгата. 2. 7. Стандарты. C. Требования к вакцинам. 1. Вводная информация
|
|
|
|
2. 6. 1. Оборудование
Планшеты из ПВХ, подходящие пипетки и мерные цилиндры, ультра-моечная машина для микрокультуральных планшетов, считыватель планшетов для твердофазного ИФА, аналитический фильтр 405–410 нм и эталонный фильтр 630 нм.
2. 6. 2. Антиген
i) Экстрагированный фенолом ЛПС S. Enteritidis доступен на коммерческой основе. Его восстанавливают в 1 мл деионизированной воды и хранят при –20°C аликвотами по 100 мкл в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФФР), pH 7, 2 в концентрации 2, 5 мг/мл. Для использования антиген должен оттаять в посадочном буфере при сохранении нужной концентрации.
ii) Антиген ЛПС также можно приготовить по методике Westphal & Luderitz (1954), стандартизировать по углеводной концентрации методом Gerhardt (1981) и подогнать до 1000 мкг/мл.
2. 6. 3. Разбавитель сыворотки и конъюгата
К ЗФФР (100 мл) добавляют бычий сывороточный альбумин (БСА) (2 г) и Tween 20 (0, 05 мл). (В альтернативном варианте вместо БСА можно использовать сухое молоко [1 г]). Материал хранят при температуре 4°C и каждую неделю готовят свежие растворы.
i) Посадочный буфер
К деионизированной воде (1 литр) добавляют карбонат натрия (1, 59 г), бикарбонат натрия (2, 93 г) и подгоняют до уровня pH 9, 6. Материал хранят при 4°C и обновляют каждые 2 недели.
ii) Субстратный буфер
Готовят 10% раствор (объем/объем) диэтаноламина в деионизированной воде. Диэтаноламин надо предварительно подогреть до 37°C перед дозированием, подогнав pH раствора до 9, 8 1 М соляной кислотой. Материал хранят при 4°C и обновляют каждые 2 недели.
iii) Конъюгат фермента
Козий противокуриный иммуноглобулин или противокуриный глобулин других видов конъюгируют со щелочной фосфатазой. Материал хранят при температуре 4°C в разбавителе при соответствующей концентрации и обновляют каждую неделю.
|
|
|
iv) Ферментный субстрат
Одну таблетку p-нитрофенилфосфата динатрия (5 мг) растворяют в субстратном буфере (5 мл) не ранее чем за 30 минут перед дозированием и хранят в темном месте.
2. 7. Стандарты
i) Положительная контрольная антисыворотка, приготовленная посредством внутримышечной инъекции четырем 1-недельным цыплятам, свободным от специфического патогенного микроорганизма, инокулята, содержащего 106 S. Enteritidis. Через 3–4 недели, когда титры антител достигли максимума, получают сыворотку.
ii) Отрицательная контрольная сыворотка A от четырех 1-недельных птиц, свободных от специфического патогенного микроорганизма.
iii) Отрицательная контрольная сыворотка B от 58 1-недельных племенных птиц, заведомо свободных от инфекций Salmonella. Сыворотки объединяют и хранят в объемах по 100 мкл при температуре –20°C.
C. ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИНАМ
1. Вводная информация
1. 1. Обоснование и предполагаемое использование препарата
В практике используют многие инактивированные вакцины против сальмонеллеза, вызванного различными сероварами сальмонелл у разных видов животных и птиц, включая комбинированную вакцину Enteritidis и S. Typhimurium для домашней птицы. Инактивация обычно достигается или посредством нагревания, или за счет использования формалина и адъюванта, например, гидроокиси алюминия или минерального масла. Во многих странах также использовались живые вакцины, включая полушероховатые штаммы, такие как 9R для птичьего тифа и HWS51 для инфекций S. Dublin (Mastroeni et al. , 2001). Другие аттенуированные вакцины включают ауксотрофные мутанты и мутанты «метаболического дрейфа», которые используют для предотвращения инфекций Salmonella у сельскохозяйственных животных в Германии, а также для S. Enteritidis и S. Typhimurium у домашней птицы в Великобритании и других странах. Для домашней птицы и других видов были разработаны мутантные вакцины, рационально аттенуированные при помощи молекулярно-биологических методик генной делеции. Они включают мутанты гена aroA и штаммы с мутациями в генах кодирующих аденилатциклазу (cya) и рецепторный белок циклического аденозинмонофосфата (crp) (Desin et al., 2013; Hassan & Curtiss III, 1997). Рекомендации по производству ветеринарных вакцин даны в главе 1. 1. 8 Принципы производства ветеринарной вакцины. Рекомендации, приведенные здесь и в главе 1. 1. 8, носят общий характер и могут быть дополнены с учетом национальных и региональных требований. Производство большинства вакцин организовано как высоко индустриальный коммерческий процесс, который находится под контролем национальных лицензирующих органов по ветеринарным лекарствам. Частные лаборатории производят экстренные стадные
|
|
|
вакцины или аутогенные вакцины в меньшем количестве, но каждое производство такого рода должно получить специальное лицензирование.
2. Краткое описание производства и минимальные требования к традиционным вакцинам
2. 1. Характеристики посевного вируса
2. 1. 1. Биологические характеристики
Бактериальный штамм для убитых или живых вакцин должен представлять собой микроорганизм, по возможности, максимально близкий к циркулирующим в настоящее время полевым штаммам. Его надо тщательно выбирать из материала, связанного со случаями тяжелой клинической болезни, а также обязательно оценивать вирулентность и выработку антигенов. Лучше всего провести подробную оценку группы потенциальных штаммов прежде, чем анализировать конечный выбор одного штамма. Конечный вакцинный штамм должен быть идентифицирован по хронологическим записям и охарактеризован стабильными фенотипическими или генетическими маркерами. Живые вакцинные штаммы должны быть маркированы стабильными признаками, позволяющими отличить их от штаммов дикого типа. Можно использовать такие маркеры как резистентность к противомикробным препаратам, например, рифампицину, или ауксотрофные мутации. Ослабление вирулентности должно быть стабильным и, предпочтительно, полученным за счет двух определенных независимых мутаций. Стабильность живых вакцинных штаммов можно верифицировать регулярными проверками, используя чувствительный молекулярный метод идентификационных отпечатков и микроматричные методики.
|
|
|
