Микроскопические методы исследования

Микроскопические методы исследования

Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном состоянии.

Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой-либо одной краски, например, метиленового синего или фуксина. Вторые преду­сматривают воздействие на один и тот же препарат двух и более красок. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения), помогают дифференцировать сходные по величине и форме бактерии, принадлежащие к различным группам.

Приготовление препаратов для микроскопии живых микроорганизмов

Для исследования живых бактериальных клеток раз­работан ряд методов. При микроскопии можно использовать культуры, выращенные в жидких средах, однако для получения нужного числа бактерий они нуж­даются, как правило, в разведении стерильной средой. Культуры, выращенные на твердых средах, можно суспендировать (развести) с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь рас­твора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения. Следует помнить, что возраст культуры и физико-химические параметры среды могут быть причи­ной ненаследуемых (фенотипических) модификаций как внепротоплазматических компонентов (жгутики и кап­сулы), так и компонентов, находящихся внутри собствен­но клетки (различные включения); все эти компоненты являются важными признаками, по которым ведется идентификация. Вместе с тем специальные операции или пересевы, производимые в лаборатории, могут благо­приятствовать развитию мутантов, имеющих наследст­венно измененные по сравнению с диким типом черты строения. Изменения могут быть стабильными и неста­бильными, но очевидно, что при описании формы и структуры бактерий условия содержания культуры должны быть строго определенными, так как старение культуры и изменения состава среды могут быть причи­ной ряда морфологических изменений.

Ниже мы приводим методы, которые часто используются при исследовании живых клеток в целях идентификации.

Для приготовления влажных препаратов одну каплю пробы (около 0, 05—0, 1 мл) помещают на чистую обез­жиренную поверхность предметного стекла (толщиной 0, 8—1, 0 мм), затем накрывают ее покровным стеклом. По­следнее имеет форму квадрата со стороной 22 мм, толщина его составляет от 0, 13 до 0, 16 мм (номер 1 или 1¹/₂). Чтобы предотвратить конвекционные токи, смеще­ние или высыхание, зазор между покровным и предмет­ным стеклами герметично заливают васпаром (смесь равных объемов петролатума и парафинового воска), петролатумом, свечным воском (используя фитиль свечи в качестве кисточки для нанесения расплавленного вос­ка) или прозрачным лаком для ногтей.

В течение короткого промежутка времени в этих пре­паратах можно наблюдать подвижность облигатных аэробных бактерий, однако, как только кислород исто­щится, бактерии прекращают движение.

Для рассматривания влажных препаратов рекомен­дуется фазово-контрастная микроскопия, причем для по­лучения наилучших результатов следует использовать как можно более тонкую водную пленку. Кусочек промо­кательной бумаги, положенный поверх покровного стек­ла для герметизации, способствует выводу излишнего ко­личества жидкости (так что в препарате остается лишь необходимая для просмотра тонкая пленка) и подсушиванию поверхности потенциальных полей зрения. Тепло от источника света может нарушить оптималь­ные движения бактерий. Если наблюдения ведутся в те­чение длительного периода времени, рекомендуется вставлять тепловой фильтр. Поскольку белый свет может вызывать нарушение подвижности, применяют зеленый светофильтр, лучше других реализующий коррекции, да­ваемые линзами, и хорошо воспринимаемый глазом на­блюдателя. Нагревание пробы предотвращают также с помощью задерживающей оптической вставки, запол­ненной 5-сантиметровым слоем раствора Мора (50 г сульфата железа и аммония, 1, 3 мл 33%-ной (объ­ем/объем) серной кислоты и 250 мл дистиллированной воды).

Поступательное перемещение бактерий за счет жгу­тиков можно наблюдать во влажных препаратах, при­меняя в большинстве случаев иммерсион­ный масляный объектив. Скорость перемещения бактерий варьирует, и медленно движущиеся организмы следует отличать от тех, которым свойственно лишь броуновское движение. Описаны некоторые неподвижные мутанты, обладающие жгутиками. Чтобы убедить­ся в том, что жгутики действительно присущи данной бактерии, а также чтобы определить их расположение (полярное, перитрихальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания.

Если используется обычный конденсор и масляно-иммерсионный объектив, для улучшения контраста количе­ство света нужно уменьшить апертурной диафрагмой, а конденсор опустить. Наиболее эффективный (и наибо­лее демонстративный) способ наблюдения за подвижны­ми микроорганизмами при малом увеличении—это темнопольная микроскопия. Необходимые для нее специ­альные конденсоры доступны далеко не всем, однако вполне удовлетворительное темное поле можно получить, применив для освещения иммерсионный конденсор от фазово-контраст­ного микроскопа и расположенную на нужном месте фазовую пластинку; наблюдения при этом ведут с помощью обычных (не фазово-контраст­ных) объективов с увеличением 10^´ или 45^´ . Иммерсионная жидкость на конденсор не наносится, а положение конденсора, для которого характерно самое хорошее темное поле, находится экспериментальным путем. С помощью этого ухищрения оказывается возможным увидеть под малым увеличением даже спирохеты.

Некоторым бактериям присущ особый тип поступа­тельного движения при контакте с твердой поверх­ностью, известный как «скольжение». Это относительно медленное, моментами прекращающееся, а затем возоб­новляющееся продвижение в направлении, параллельном продольной оси организма. Для скольжения характерна частая смена направлений движения и отсутствие на­ружных локомоторных органелл. Такого типа под­вижность можно предположить, если при микроскопическом обследовании (с безиммерсионными объективами большого увеличения) краев колоний обнаруживают отделенные от самого края одиночные клетки или группы клеток. Часто в первичной среде выделения скольжение не выявляется; обычно его легче обнаружить на твердых средах с небольшим количеством питательных веществ, соответствующих их содержанию в естественной для данной группы среде обитания.

Скольжение следует отличать от роения, которое вы­ражается в движении за счет жгутиков в особых усло­виях. Роение—это распространение микроорганизмов по относительно сухой поверхности, например, агара, где они движутся в виде больших протяженных островков или микроколоний. У наблюдаемых при этом скоп­лений постоянно меняются очертания — от коротких языковидных выступов и изолированных групп до пере­плетающихся полос, чередующихся с пустотами. В мес­тах этих пустот видны следы движения, часто рассматри­ваемые в качестве признака скольжения и хорошо со­храняющиеся фиксацией по Боуэну in situ. Молодые активные культуры нитевидных организмов, передвигающихся скольжением, оставляют волнообраз­ные, завитые или спиралевидные рисунки. Поступатель­ное перемещение путем скольжения происходит со ско­ростью 10—15 мкм/с.

Раздавленная капля. На предметное стекло нано­сят каплю бульонной культуры. При обильном росте микро­бов культуру предварительно разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Нанесен­ную на предметное стекло каплю раздавливают. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли и, опуская, постепенно вытесняют воздух, находящийся между предметным и покровным стеклами, чтобы избежать образования пузырьков. В правильно приготовленном препарате раздавленной капли стекла плотно склеиваются и жидкость тончайшим слоем заполняет пространство между ними, не выступая за края покровного стекла.

Висячая капля. На середину необезжиренного покровного стекла наносят небольшую, с четкими краями каплю бульонной культуры. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом перевертывают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно, и поэтому препарат долгое время остается пригодным для наблюдения. Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (8^´ ) находят край капли, отчетливо видный в затемненном поле зре­ния. По одну сторону линии (края) видно множество мель­чайших капелек конденсата, осевших на внутренней поверх­ности покровного стекла, по другую сторону линии фон равномерно серого цвета — искомая капля. Найденный край капли устанавливают в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении и, не сдвигая препарата, переходят на более сильную (40^´ или иммерсионную) систему, слегка расширив диафрагму микроскопа.

Живые микробы, находящиеся в препарате раздавленной капли, можно изучать и в темном поле зрения. При этом методе микроскопии толщина предметных стекол не должна превышать 1, 2 мм, покровных—0, 2 мм. Принцип исследования микробов в темном поле зрения заключается в том, что в объектив и, следовательно, в глаз наблюдателя попадают не прямые лучи света, а отраженные исследуемым объектом. Вследствие этого неосвещенное поле зрения оста­ется совершенно темным, а микробные тела, отражающие лучи света, освещены очень ярко.

Для создания темного поля конденсор Аббе заменяют темнопольным конденсором, имеющим затемнение центральной части. При отсутствии специального берут обычный кон­денсор Аббе, развинчивают и вкладывают между его линзами кружок черной фотобумаги так, чтобы незначительная периферическая часть линзы оставалась свободной.

При микроскопии препаратов в темном поле зре­ния на верхнюю поверхность конденсора наносят каплю кед­рового или вазелинового масла, поверх которой очень осто­рожно, чтобы не образовалось пузырьков воздуха, накладывают препарат. На покровное стекло наносится вторая капля масла. Наносить масло на обе поверхности препарата необходимо для того, чтобы при микроскопии с иммерсионной системой проходящие лучи света не преломлялись.

Метод висячего агарового слоя. Для приготовления препаратов живых клеток типа «висячая капля» существует хорошее приспособление — пластина из прозрачной пластмассы с высверленным в центре отверстием, имеющим диаметр около 1 см. По­кровное стекло с висящей на нем каплей помещают над отверстием, а для того, чтобы стекло удерживалось на месте, на его край наносят каплю иммерсионного масла или воды. Подобным образом к стеклу можно прикре­пить тонкий слой агара с растущей культурой или островками колоний, размазанных по стерильной нахо­дящейся рядом с ними поверхности. Образуемую отвер­стием камеру можно закрыть, прикрепив снизу покров­ное стекло.

Негативное окрашивание. Этот вид окрашивания дает возможность самыми простыми, а зачастую и самыми быстрыми способами получить информацию о преломляющих свет включени­ях, таких, как сера или гранулы поли-(р)-окси­масляной кислоты, и о спорах. При его осуществлении взя­тый петлей 7%-ный (вес/объем) водный нигрозин (или тушь, или конго красный) тщательно перемешивают с бактериальной суспензией на покровном стекле, разма­зывают смесь до образования тонкой пленки и высуши­вают на воздухе. Затем кладут покровное стекло на предметное пленкой вниз и фиксируют его положение одной-двумя каплями свечного воска. В приготовленных подобным образом препаратах, со­держащих вместо заливки воздушный слой, бактерии не прокрашиваются и выделяются на темно-синем фоне яр­ким свечением. В дальнейшем они даже могут быть ис­пользованы в работах по изучению характера и степени разрушения клеток. Негативно окрашенные пре­параты не следует применять для измерения длины и ширины клеток, так как вокруг клеточной стенки может находиться капсула или слой слизи. Более того, отрицательно заряженные частицы коллоидного нигрозина не реагируют с клеточной поверхностью, по­скольку при физиологических значениях рН последняя также заряжена отрицательно. При высыхании коллоид­ной пленки благодаря одинаковому заряду коллоидных частиц и бактерий черный край высыхающей пленки на­ходится на относительно значительном, хотя и малень­ком абсолютно расстоянии от истинной границы клетки. В результате видимый размер бактерии оказывается больше, чем действительный, даже если нет капсулы.

В растворах нигрозина могут появиться посторонние микроорганизмы; предотвратить это помогает небольшая добавка формальдегида, не ухудшающая свойств рас­твора.