 |
Таблица пересчета НВЧ и пределы с 95% вероятности при использовании 3-х пробирок
|
|
|
|
Таблица пересчета НВЧ и пределы с 95% вероятности при использовании 3-х пробирок
| Число положительных пробирок с разведениями
| НВЧ на 1 г или 1 мл | Пределы с 95% вероятности
| |||
| 1: 10 | 1: 100 | 1: 1000 | минимальный | максимальный | |
| менее 3 | |||||
| менее 0, 5 | |||||
| менее 0, 5 | |||||
| менее 0, 5 | |||||
| более 2400 | |||||
|
|
|
4. 4. 2. 4. Определение E. coli по методу НВЧ
При необходимости определения E. coli в исследуемом на БГКП продукте по методу НВЧ одновременно с подтверждающим пересевом на ЖЛБ с бриллиантовой зеленью может быть сделан пересев из всех пробирок с наличием признаков роста на среде КОДА на среду Кесслер с лактозой или на среду для E. coli (п. 6. 7. ) - ЕС-бульон. Засеянные пробирки инкубируют при 44 °С±1 °С 24 часа и регистрируют образование газа.
Для дифференциации выделенных культур применяют реакции на индол, метил-рот, Фогес-Проскауэр и цитрат.
Из пробирок с положительной реакцией (образование газа) штрихом производят посев на чашку с агаром Левина таким образом, чтобы получить изолированные колонии, и инкубируют 18-24 часа при 37 °С.
Переносят 2-3 колонии с каждого выросшего посева на среде Левина на чашку или пробирку со 2% ИПА и инкубируют 18-24 часа при 37 °С. В то же время из каждой культуры готовят мазки и производят окраску по Граму.
Постановка тестов ИМАЦ
Тест на индол
Культуру со скошенного МПА инокулируют в пробирку с 5 мл индольной среды (п. 6. 10. ) и инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. Добавляют 1 мл индольного реактива. При наличии индола в пограничном слое в течение 5 мин появляется красное окрашивание - положительная реакция.
Реакция Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол)
Культуру со скошенного агара петлей вносят в пробирку с 5 мл среды Кларка (п. 8. 12. ). Посев инкубируют при 37 °С в течение 48 часов. Затем к 1 мл культуры добавляют 0, 6 мл этанолнафтольного реактива и 0, 2 мл раствора КОН. Встряхивают после добавления каждого реактива и читают реакцию через 15 минут. Учет результатов возможен и через 2 часа. Окраска от розовой до ярко-красной показывает, что реакция на образование ацетилметилкарбинола положительная.
|
|
|
Тест с метил-рот
Инокулируют пробирку со средой Кларка и инкубируют в течение 48 часов при 36 °С±1 °С; (параллельно с постановкой реакции на ацетилметилкарбинол); в оставшиеся после постановки реакции Фогеса-Проскауэра 4 мл культуры добавляют 4-5 капель индикатор метил-рот в каждую пробирку. Реакция ферментации углеводов с образованием кислоты положительная, если появилось красное окрашивание.
Тест с утилизацией цитрата
Культуру с МПА пересевают в пробирку со средой Козера (цитратной) и инкубируют 96 часов при 37 °С и проверяют рост. Отсутствие роста и изменения цвета среды - реакция отрицательная. Наличие роста, изменение окраски среды с оливково-зеленого цвета на васильковый свидетельствует об утилизации цитрата - реакция положительная.
Таблица 4. 4. 2. 5.
Классификация бактерий группы кишечных палочек по тестам ИМАЦ
| Индол | Метил-рот | Фогес-Проскауэр | Цитрат | Тип |
| - | + | - | - | Типичная E. coli |
| - | + | - | - | Атипичная E. coli |
| - | - | + | + | Типичный Ent. (….. )* |
| + | - | + | + | Атипичный Ent. (.. …)* |
| + | + | - | + | Типичный Citrobacter |
| - | + | - | + | Атипичный Citrobacter |
___________________
* Брак оригинала. Примечание " КОДЕКС".
Используя табл. 4. 4. 2. 5., принимают, что E. coli - это грамотрицательные, неспорообразующие палочки, образующие газ из лактозы и дающие положительную или отрицательную реакцию на индол, положительную - с метил-рот и отрицательные реакции Фогеса-Проскауэра и на цитрат (++--) или (-+--). Количество E. coli в 1 г рассчитывают по таблице 4. 4. 2. 3., учитывая число положительных пробирок со средой Кесслер с лактозой или ЕС-бульоном, инкубированных при 44 °С±1 °С. В заключении указывают: " В 1 г (мл) продукта содержится " N" E. coli ".
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА БАКТЕРИЙ ГРУППЫ
КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК МЕТОДОМ НВЧ
5. Регистрация пробирок с наличием газа и расчет НВЧ по таблице.
|
|
|
Схема 1.
4. 4. 3. Метод определения коли-титра БГКП
Под коли-титром следует понимать наименьшее количество исследуемой пробы, выраженное в мл (вода, жидкие пищевые продукты) или в г (плотные пищевые продукты), в котором обнаруживается присутствие бактерий группы кишечных палочек.
При определении титра кишечных палочек выявляют их наличие в различных объемах исследуемого продукта.
При наличии стандартных методов подвергают исследованию те количества продукта, которые предусмотрены соответствующими ГОСТ, весь ход исследования, сроки и температура выращивания, а также количественный и качественный учет кишечных палочек должен соответствовать ГОСТ на тот или иной пищевой продукт.
4. 4. 3. 1. Методика посева пищевых продуктов, не имеющих ГОСТ*
___________________
* - В тех случаях, когда на исследуемый продукт имеется микробиологический показатель, то засевается соответствующее количество продукта (п. 4. 4. 1. )
Первый этап: Первичные посевы на среду накопления.
Засевают 4 или более десятикратно убывающих количеств пищевого продукта, например, 10, 0; 1, 0; 0, 1 и 0, 01 мл (г).
В качестве среды накопления применяют среду Кесслер с лактозой или среду КОДА. Среды разливают в пробирки не менее чем по 5 мл в пробирки для посева малых объемов (1 мл, г и менее). Для посева объема от 10 мл и более среду разливают во флаконы по 50-100 мл (применение поплавков не обязательно). Для определения титра бактерий группы кишечных палочек засевают на среду Кесслер исходную 10% взвесь в количестве 100, 0 мл (10 г продукта) во флакон со 100 мл среды двойной концентрации, 10 мл (1 г продукта) - во флакон с 50 мл среды, 1, 0 (0, 1 г продукта), а также 1, 0 мл из разведения 1: 100 (0, 01 г продукта) и т. д. - в пробирки с 5, 0 мл среды. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °С 16-24 часа.
Второй этап. Пересев на плотную среду Эндо.
Из всех пробирок с посевами на среде Кесслер или КОДА независимо от помутнения среды, производят высевы на сектора чашек со средой Эндо (при отсутствии среды Эндо пользуются средой Левина). Для получения изолированных колоний берут петлей минимальное количество материала при значительном помутнении среды Кесслер и производят посев частым штрихом. Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С на 16-24 часа.
|
|
|
Чашки с посевами на среде Эндо просматривают. При отсутствии характерных колоний на всех секторах чашки дают ответ - " титр бактерий группы кишечных палочек более 11, 1". При наличии на среде Эндо колоний, характерных для бактерий группы кишечных палочек - красных, с металлическим блеском или без него, розовых с темным центром, розовых, слизистых, бледно-розовых, производят их изучение*.
_____________________
* - лактозоотрицательные колонии (бесцветные) подвергают дальнейшему изучению для установления их возможной принадлежности к патогенным энтеробактериям, для чего высевают на среду Ресселя или Ольконицкого. Последующее изучение производят в соответствии с Инструкцией о порядке расследования, учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях, Москва, 1975 г.
Из изолированных колоний, характерных для бактерий группы кишечных палочек, готовят препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. В случае обнаружения в препарате смешанной культуры, выбирают другую колонию и производят рассев на чашку со средой Эндо для получения чистой культуры. При отсутствии в мазках грамотрицательных палочек дают ответ - " титр бактерий группы кишечных палочек выше 11, 1".
Заключение о наличии бактерий группы кишечных палочек только по внешнему виду колоний, без их изучения, недопустимо.
В случае обнаружения в препаратах грамотрицательных палочек исследование продолжают. Из проверенных колоний грамотрицательных палочек производят высевы на среду Гисса с глюкозой, разлитую в пробирки с поплавками. При наличии однотипных колоний грамотрицательных палочек на всех 4 секторах чашки со средой Эндо допускается высев колоний на среду Гисса с глюкозой из двух последних секторов (разведений). Инкубация при 37 °С 18-24 часа. Для ускорения анализа высевы из колоний производят в пробирки с небольшим количеством подогретой до 37 °С среды (1, 5-2, 0 мл). Пробирки с посевами ставят в термостат при 37 °С и просматривают через 5-6 часов роста. Наличие кислото- и газообразования в них указывает на присутствие бактерий группы кишечных палочек в том или ином засеянном объеме; пробирки с посевами, не забродившими через 4-6 часов, вновь помещают в термостат при 37 °С и выдерживают до 16-24 ч.
4. 4. 3. 2. Учет результатов
Для установления коли-титра применяют стандартные таблицы. Пользование таблицами возможно только при определенном количестве засеянных объемов. Чаще всего для пищевых продуктов, на которые не имеется ГОСТ, используются таблицы, рассчитанные на посевы 4 десятикратно убывающих количеств от 10, 0 г до 0, 01 г. Если предполагается более интенсивное обсеменение продукта бактериями группы кишечных палочек, то производят посевы больших разведений от 0, 001 до 0, 00001 г для вычисления титра бактерий группы кишечных палочек, пользуются таблицами 4. 4. 3. 4., 4. 4. 3. 5., 4. 4. 3. 6. в зависимости от того, в каком разведении еще обнаруживается рост кишечных палочек, заканчивая учет двумя последними разведениями, в которых имеется наличие (в предпоследней) и отсутствие (в последней пробирке) роста бактерий группы кишечных палочек. Например, 0, 1+; 0, 01+; 0, 001+; 0, 0001-. В данном случае следует пользоваться таблицей 4. 4. 3. 5. Для данной комбинации результатов коли-титр равняется 0, 0004.
|
|
|
|
|
|
