Упаковка генетического материала

Главная количественная особенность генетического материала эукариот – наличие избыточной ДНК. Этот факт легко выявляется при анализе отношения числа генов к количеству ДНК в геноме бактерий и млекопитающих. Около 95% генома бактерий состоит из кодирующих последовательностей. Остальные 5%, по-видимому, заняты регуляторными элементами. Иная картина наблюдается у эукариотических организмов. Например, у человека насчитывают приблизительно 50 тысяч генов (имеется в виду только суммарная длина кодирующих участков ДНК – экзонов). В то же время размер генома человека 3×109 (три миллиарда) п.н. Это означает, что кодирующая часть его генома составляет всего 15 - 20 % от тотальной ДНК. Существует значительное число видов, геном которых в десятки раз больше генома человека, например некоторые рыбы, хвостатые амфибии, лилейные. Избыточная ДНК характерна для всех эукариот.

По химическому составу хроматин представляет собой комплекс ДНК и белков. В ДНК эукариот выделяют 3 фракции:

уникальные последовательности – у животных составляют 40-90% от всей ядерной ДНК; у растений – 12-60%. У человека около 50% ядерной ДНК представлено уникальными последовательностями длиной 1-2 тпн. Эти фрагменты разделены между собой умеренно повторяющимися последовательностями длиной 0,1-0,3 тпн. Большая часть уникальной ДНК является "некодирующей", так, например, в геноме человека из 50% уникальной ДНК на кодирующие участки приходится только 5%.

Умеренно повторяющиеся последовательности ДНК кодируют, как правило, тРНК, рРНК, гистоны. Пример, гены 18S и 28S рРНК образуют тандемные пары (мономерные единицы расположены по типу "голова к хвосту"). Спейсер тоже транскрибируется, в его состав входит ген 5,8S рРНК. У человека и мыши гены рРНК располагаются в нескольких кластерах в акроцентрических хромосомах. Каждый кластер генов рРНК соответствует ядрышковому организатору. Гены ранних гистонов у морского ежа входят в состав одной единицы, в результате повторения которой образуется кластер тандемных генов, разделяемых спейсерами – Н1 Н4 Н2В Н3 Н2А. У некоторых млекопитающих гены гистонов располагаются по отдельности.

Сателлитная ДНК – высокоповторяющиеся последовательности ДНК. Располагаются в центромерных, теломерных районах и в участках интеркалярного гетерохроматина. У разных видов на долю сателлитной ДНК приходится от 0,3% до 28% от всей ядерной ДНК. Близкие виды, например мышь и крыса, имеют совершенно различные высокочастотные последовательности, у крысы их нуклеотидный состав не отличается от основной ДНК, тогда как геном мыши содержит четкий АТ-богатый сателлит. Это означает, что высокочастотная ДНК способна к быстрым изменениям в ходе видообразования.

Последовательности сателлитной ДНК – это короткие тандемные повторы. У человека сателлитная ДНК делится на I, II, III классы (с длиной повторяющейся последовательности 1-20 п.н.). Также выделяют альфа, бета и гамма типы (с длиной повтора 170 п.н., 68 п.н. и 220 п.н. соответственно). Сателлитные повторы имеют различную степень обогащенности АТ- и ГЦ –пар (тип 1 обогащен парами АТ). Сателлитная ДНК специфично распределена по разным хромосома. Так, в прицентромерном гетерохроматине хромосом 3 и 4 представлен сат ДНК 1. В прицентромерном гетерохроматине хромосом групп Д и G локализованы сатДНК1 и 3 классов. Распределение альфа, бета и гамма сателлитных ДНК также хромосом специфично. Альфа сателлитные повторы располагаются в основном в центромерных участках хромосом. Имеют элементапрную единицу повтора около 170 п.н. и могут присутствовать в тандеме, достигающем длины до 1 млн.п.н.

В сателлитной ДНК выделяют 2 типа последовательностей:

- микросателлиты – единица повтора состоит из 1-5 нуклеотидов. Общая длина кластера – несколько десятков нуклеотидов. Пример: (АТ)n; (A)n; (AC)n. В кодирующей части генов чаще встречаются тринуклеотидные повторы. Ди-, тетра- и пентануклеотидные повторы редки в кодирующей части генома, так как увеличение их числа обязательно приведет к сдвигу рамки считывания. Микросателлитные последовательности обнаружены в геноме как прокариот, так и эукариот. Из-за высокой скорости мутирования микросателлиты обеспечивают генетическое разнообразие геномов.

- минисателлиты – единица повтора состоит из 10-100 пн. Общий размер кластера 0,5-100 тпн.

Общий размер кластера 0,5-100 тпн. Их еще называют VNTR – вариабельные по числу тандемные повторы. Они могут находиться внутри или между генами. Число копий каждой специфической последовательности в разных локусах варьирует от 1000 до 5000 п.н. Вариации длин таких областей лежат в основе метода ДНК-фингерпринтинга (метод отпечатков).

По локализации выделяют:

- сателлитные повторы в области промотора – (А)n – стимулирует экспрессию гена, т.к. обуславливает жесткую структуру двойной спирали – на этом участке не образуются нуклеосомы, что облегчает доступ ДНК-полимераз и факторов транскрипции к промотору. Длина полипролиновых, полиаланиновых и полиглутаминовых участков, кодируемых микросателлитными тринуклеотидными повторами, влияет на белок-белковые взаимодействия, в том числе и с факторами активации транскрипции.

- сателлитные повторы в интронах – часто ингибируют экспрессию гена. (АС)21 в интроне гена рецептора эпидермального фактора роста снижает транскрипцию гена на 80%.

- сателлитные повторы в нетранслируемой 5-области гена (между промотором и геном) – (С)n, (AC)n, (GC)n, (AT)n – ингибируют экспрессию гена.

- повторы в транслируемой области гена. Пример – хорея Гентингтона – увеличение длины повтора (CAG)n в первом экзоне гена белка гентингтина приводит к удлинению полиглутаминового участка в белке. Синтезируется токсичная форма белка, что приводит к гибели нейронов. Это пример динамических мутаций или экспансии тринуклеотидных повторов – связаны с изменением длины тринуклеотидных повторов. Скорость мутирования связана с числом копий триплета. После превышения определенного порога длины эти повторы становятся нестабильными и их длина увеличивается в последующих поколениях. У здоровых людей число повторов колеблется от 6 до 39. У больных – 36-180. У взрослых болезнь проявляется при 40-55 повторах, при числе повторов больше 70 заболевание проявляется уже у детей. То есть для данных мутаций характерно явление антиципации – возрастание пенетрантности заболевания в ряду поколений, более раннее начало заболевания.

Впервые динамические мутации описаны в 1991 году. Известны они только у людей. Всего пока описано 16 наследственных заболеваний (табл. 6.1). Все они связаны с поражением головного мозга и подкорковых структур. Экспансия происходит как в мейозе, так и в митозе, затрагивает чаще аллели с изначально большим числом повторов.

Динамические мутации являются причиной развития синдрома фрагильной Х-хромосомы или синдрома Мартина-Белл. Синдром Мартина-Белл – одна из наиболее частых наследственных форм умственной отсталости (частота заболевания составляет 1 случай на 4000 мужчин и 1 случай на 8000 женщин). Синдром связан с образованием ломкого сайта в Х-хромосоме из-за увеличения повторов (CGG) в 5-нетранслируемой области гена FMR1, который экспрессируется в мозге и семенниках. Ген кодирует РНК-связывающий белок, циркулирующий в клетке между ядром и цитоплазмой. У здоровых людей ген содержит 2-54 триплета (CGG). Увеличение длины до 200 триплетов – это предмутационное состояние, не изменяющее фенотип человека. Увеличение числа копий свыше 200 триплетов – полная мутация и проявление синдрома. Увеличение числа копий триплета приводит к гиперметилированию регуляторной зоны гена (промотора), в результате резко снижается или полностью ингибируется транскрипция ген.

Таблица 6.1.

Болезни экспансии повторяющихся последовательностей

Заболевание	Ген	Локус	Тип повтора
Болезни экспансии некодирующих повторов
Синдром Мартина-Белл	FMR1	Xq27.3	CGG
Атаксия Фридрейха	X25	Xq13-21.1	GAA
Миотоническая дистрофия, тип 1	DMPK	19q13.3	CTG
Спиноцеребеллярная атаксия, тип 8	SCA8	13q21	CTG
Спиноцеребеллярная атаксия, тип 12	SCA12	5q31-33	CAG
Спиноцеребеллярная атаксия, тип 10	SCA10	22q13	ATTCT
Миотоническая дистрофия, тип 2	ZNF9	3q21	CCTG
Болезни экспансии кодирующих повторов
Спинобульбарная мышечная атрофия (болезнь Кеннеди)	AR	Xq13-21	CAG
Хорея Гентингтона	HD	4p16.3	CAG
Дентато-рубро-паллидо-льюисова атрофия	DRPLA	12p13.31	CAG
Спиноцеребеллярная атаксия, тип 1	SCA1	6p23	CAG
Спиноцеребеллярная атаксия, тип 2	SCA2	12q24.1	CAG
Спиноцеребеллярная атаксия, тип 3	SCA3	14q32.1	CAG
Спиноцеребеллярная атаксия, тип 6	CACNL1A4	19p13	CAG
Спиноцеребеллярная атаксия, тип 7	SCA7	13p12-13	CAG
Спиноцеребеллярная атаксия, тип 17	TBP	6q27	CAG

Еще одна категория повторов в геноме эукариот – короткие и длинные разбросанные по геному ДНК-повторы (не тандемные).

Короткие рассеянные по геному элементы – SINE – последовательности длиной менее 500 п.н. Их копийность в геноме человека составляет не менее 500 000. К этой группе повторов относится семейство Alu-повторов (они содержат сайты рестрикции для эндонуклеазы AluI). Alu-повторы в геноме человека составляют более 5% от суммарного количества ДНК. Функция их не ясна.

Другая группа рассеянных повторов – LINE. У человека обнаружено одно семейство этих повторов – L1-повторы. Длина повтора около 6400 п.н., суммарно представлены в геноме до 100000 раз. Проявляет свойства ретротранспозонов (транскрипция последовательности, синтез на мРНК с помощью обратной транскриптазы новой копии ДНК повтора, новая копия интегрирует в хромососму на новом месте).

Эухроматическая часть генома построена по принципу чередования (интерсперсии) уникальных и повторяющихся последовательностей. Условно выделяют два основных типа интерсперсии, получивших названия по тем видам, у которых они впервые были описаны: интерсперсия типа "ксенопус" и типа "дрозофила".

Примерно в 50 % генома Xenopus laevis уникальные последовательности из 800-1200 п.н. чередуются с повторяющимися, средний размер которых 300 п.н. В остальной части геномов типа "ксенопус" расстояния между соседними повторами значительно превышают 1-2 п.н. Структура генома типа "ксенопус" широко распространена, особенно среди животных. Млекопитающие и человек также относятся к этому типу организации генома. Особенность генома человека и других приматов составляют интерсперсные высокочастотные повторы длиной около 300 п.н. У человека эти повторы содержат сайт, разрезаемый ферментом рестрикции Alu I.

В ядре ДНК всегда находится в комплексе с белками и упакована в той или иной степени в нуклеопротеиновые структуры.

В хромосомах ДНК (около 40% от всего хроматина) находится в комплексе с основными и кислыми белками, что обеспечивает многоступенчатую компактизацию молекулы ДНК. Первые уровни компактизации осуществляются при взаимодействии ДНК с основными белками – гистонами. Гистоны имеют повышенное содержание основных аминокислот – лизина и аргинина. Пять типов гистонов отличаются друг от друга относительным содержанием этих двух аминокислот. Гистоны Н3 и Н4 очень консервативны. Секвенирование гена гистона Н4 показало, что у теленка и гороха этот белок отличается всего двумя аминокислотами. Наиболее изменчивы гистоны Н2А и Н2В. Комплекс между ДНК и гистонами формирует нуклеосомную структуру хроматина. Пары молекул гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4 формируют гистоновый октамер клиновидной формы (рис. 6.1.). Узкая часть образована тетрамером Н3-Н4, а широкая состоит из Н2А-Н2В. N-концевые части гистонов свободно расходятся в стороны. Участок ДНК в 146 пн связывается с октамером, делая 1,75 оборота вокруг него. Комплекс данного участка ДНК с гистоновым октамером называют нуклеосомой. Участок ДНК между соседними нуклеосомами называют линкерным (около 60 пн). Более 90% ДНК в клетке присутствует в виде нуклеосом, при этом длина нити ДНК уменьшается в 7 раз, а толщина сформированной нуклеопротеиновой нити составляет 10 нм.

Гистоны контактируют с фосфодиэфирным остовом молекулы ДНК. Существуют и гидрофобные взаимодействия с остатками рибозы. Азотистые основания во взаимодействии с гистонами не участвуют. Поэтому связывание ДНК с нуклеосомной глобулой не является специфичным в отношении нуклеотидной последовательности.

Гистон Н1 взаимодействует с обоими концами ДНК, входящей в состав нуклеосомы, в районе тетрамера Н3-Н4, т.е. Н1 как бы обозначает границы линкерной ДНК. В молекуле гистона Н1 можно выделить глобулярную сердцевину, N-конец и С-конец. Взаимодействие между N- и С-концами соседних молекул гистона Н1 обеспечивает сближение нуклеосом. При этом нуклеосомная нить сворачивается в спираль или образует зигзагообразную нить толщиной 30 нм, состоящую из сближенных нуклеосом – нуклеомеров. Каждая нуклеомера состоит из 8-10 нуклеосом.

Исследования последних лет подтверждают зигзагообразную модель организации 30 нм фибриллы. В стабилизации этой фибриллы большую роль играют взаимодействия N-концевых доменов гистонов соседних нуклеосом. Архитектура фибриллы может существенно меняться при модификации N-концевых доменов гистонов, что может стимулировать либо дальнейшую конденсацию, либо деконденсацию фибриллы. Есть данные о том, что ацетилирование гистонов способствует разворачиванию компактной 30 нм хроматиновой фибриллы до нуклеосомной нити (рис. 6.3.).

У ксенопуса выделены белки, контролирующие взаимодействие ДНК с гистоновыми белками. Например, белок нуклеоплазмин – состоит из 5 идентичных субъединиц, контролирует образование нуклеосом. Этот белок кислый, он не связывается со свободной ДНК, связывается только с гистонами.

Экспрессия генов основных гистонов происходит только в S–фазу чтобы обеспечить упаковку вновь синтезированной ДНК. Но ограничение синтеза гистонов может грозить нарушением целостности хромосом, например, при репарации поврежденной ДНК. Поэтому многие организмы имеют альтернативные копии гистоновых генов, которые кодируют варианты гистонов и экспрессируются конститутивно на низком уровне в течение всего клеточного цикла.

 

Описаны вариантные формы гистонов (табл. 6.2), которые кодируются отдельными генами. Включение в нуклеосомную частицу вариантных форм гистонов может существенно изменять структуру гистонового октамера. Существует четкая корреляция между присутствием в нуклеосомах вариантных форм гистонов и осуществлением тех или иных функциональных процессов. Например, ряд вариантных форм гистона Н3 (CENP-A) участвует в формировании центромер. Некоторые варианты обмениваются с уже существующими гистонами в ходе развития и дифференцировки – их называют замещающими гистонами. Такое замещение часто приводит к тому, что варианты становятся доминируюшщими в дифференцированной клетке. Предположение – варианты гистонов выполняют спец. функции в клетках.

Имеется много вариантов гистона Н1, например, Н10, Н5, варианты, специфичные для сперматозоидов (SpH1) и яичек (H1t). Наибольшее число вариантов описано для гистона Н2А. Варианты гистона Н2А отличаются по размеру и последовательности хвоста, а также по характеру распределения в геноме. Например, H2A-Bbd локализуется в активной Х-хромосоме и аутосомах, а Macro Н2А находится в основном в Xi. У гистона Н3 есть два основных варианта – Н3ю3 и центромерный Н3 (СеnH3), а также тканеспецифичный вариант Н3.4 (яички млекопитающих). Гистон СеnH3 способствует образованию белковой структуры кинетохоров. Гистон Н3.3 служит меткой активного хроматина, азмещение Н3 на Н3.3 это динамичный механизм быстрой активации хроматина. Вариантов гистона Н4 пока не известно.

Таблица 6.2 Основные варианты гистонов и их действие на хроматин

 

Вариант	Основной гистон	Действие на хроматин
Н1	Н1	Конденсация хроматина
Н5	Н1	Конденсация хроматина
SpH1	Н1	Конденсация хроматина
H1t	Н1	Открытая структура хроматина
MacroH2A	Н2А	Конденсация хроматина
H2ABbd	Н2А	Открытая структура хроматина
H2AvD	Н2А
H2A.X	Н2А	Конденсация хроматина
H2A.Z	Н2А	Открытая/закрытая структура хроматина
SpH2B	Н2В	Конденсация хроматина
CenH3	Н3
H3.3	Н3	Открытая структура хроматина
H3.4	Н3

 

Дальнейшая упаковка хроматина достигается за счет взаимодействия ДНК с негистоновыми белками. Они разнообразны – более 500, составляют до 2/3 всех белков хроматина. Многие из этих белков участвуют в репликации, репарации ДНК, транскрипции. Часть из них выполняет структурную функцию – образуют ядерную мембрану, поровые комплексы. Часть белков формирует белковый каркас хромосом. На белках ядерной мембраны в интерфазу закреплены расположенные розетками петли 30-нм фибриллы. Это третий уровень компактизации хроматина – хромомерный. Средний размер розеток достигает 120-150 нм. Каждый хромомер состоит из нескольких, содержащих нуклеомеры петель, которые связаны в одном центре. Хромомеры связаны друг с другом участками нуклеосомного хроматина. Размер отдельной петли совпадает с размером среднего репликона и может соответствовать одному или нескольким генам (50-100 тпн). На хромосому в среднем приходится более 2000 таких петельных доменов ДНК. Петельно-доменная структура хроматина организует функциональные единицы хромосом – репликоны и транскрибируемые гены. Наряду с участками начала репликации в области прикрепления ДНК к ядерному матриксу часто локализуются и другие регуляторные элементы – энхансеры, сайленсеры, промоторы и т.д. Помещение того или иного промотора, гена или генного домена на ядерный матрикс способствует его активации. Далее – хромонемный уровень компактизации – нитчатая структура толщиной 0,1-0,2 мкм. Полагают, что отрезок примерно с 18-20 петлевыми доменами образует вокруг осевого элемента хромосомы один виток.

Компактизация метафазных хромосом оценивается как 10000-кратная. К стадии зиготены мейоза наружная поверхность хроматиновой нити содержит всего около 1% ДНК. Механизм не известен. Доказано, что укладка ДНК в митотическую хромосому осуществляется комплексом белков, называемым 13S-конденсином. Комплекс обладает АТФ-азной активностью, способен связываться с ДНК и, вероятно, наматывает ее на себя. 13S-конденсин лягушки состоит из двух структурных субъединиц – ассоциированных с хромосомами белков ХСАР-С и ХСАР-Е и трех регуляторных субъединиц. Вне комплекса ни одна из субъединиц не индуцирует конденсацию хромосом. Мутации в генах, кодирующих белки конденсинового комплекса, нарушают конденсацию и сегрегацию хромосом, блокируют клетки в митозе. В процессе упаковки хромосом конденсин локализуется в районах, где гистон Н3 фосфорилирован. По мере фосфорилирования гистона Н3 ДНК становится более доступной для связывания с конденсином. Конденсация хромосом и фосфорилирование гистона Н3 начинается с центромерных областей и распространяется к теломерным.

К стадии зиготены мейоза на наружней поверхности хроматиновой нити остается всего около 1% ДНК.

Степень деконденсации хроматина в интерфазном ядре отражает его функциональную нагрузку. Чем более диффузен хроматин, тем он активнее. В составе хромосом выделяют участки гетерохроматина и эухроматина. Эухроматин в интерфазе находится в деспирализованном состоянии, в нем находятся структурные активные гены. В эухроматиновых участках, помимо элементарных дезоксирибонуклеопротеидных нитей, имеются рибонуклеопротеидные частицы диаметром 200-500 анстрем, называемые РНП-гранулами. Эти частицы представляют собой форму упаковки молекул РНК, синтезированных на ДНК и соединённых с белком, и служат для завершения образования информационной РНК и переноса её в цитоплазму

Термин "гетерохроматин" был предложен Хейцом в 1928 году. Гетерохроматин расположен в районе центромеры, теломер и внутри плеч хромосом – интеркалярный гетерохроматин. Гетерохроматиновые участки значительно дольше представлены в клеточном цикле в виде плотно спирализованных фрагментов. Они деспирализуются значительно позже, чем эухроматин или совсем не деспирализуются, сохраняясь в интерфазном ядре в виде плотно окрашенных глыбок – хромоцентров. Гетерохроматиновые районы хромосом могут ассоциироваться друг с другом – эктопическая конъюгация. В результате здесь возможна повышенная частота хромосомных перестроек. Еще одной особенностью гетерохроматина является варьирование его количества в геноме.

Гетерохроматиновые участки ДНК содержат долгоживущие разрывы, тогда как в эухроматине разрывы возникают редко и быстро репарируются. Ядра лимфоцитов периферической крови почти полностью состоят из гетерохроматина и неактивны в транскрипции. В них обнаружено около 3000 разрывов на диплоидный геном мыши. Установлено, что после активации лимфоцитов разрывы репарируются. Очень плотно упакованная ДНК сперматозоидов содержит 107 разрывов на геном. Таким образом, наличие разрывов ДНК позволяет плотную упаковку, но несовместимо с транскрипцией.

Стабильно выявляемые гетерохроматиновые районы называют конститутивным гетерохроматином. Эти районы, как правило, генетически не активны. Пример – сателлитная ДНК прицентромерного гетерохроматина. Конститутивный гетерохроматин располагается в одних и тех же положениях на обеих хромосомах из пары гомологов. Гены в гетерохроматине все-таки есть, но их гораздо меньше, чем в эухроматине. Пример – гены рРНК.

Факультативный гетерохроматин формируется при конденсации хроматина на определенных стадиях жизненного цикла и обычно присутствует лишь в одной хромосоме из пары гомологов.

У млекопитающих факультативный хроматин проявляется при инактивации Х-хромосомы. В 1949 г Барр и Бертрам обнаружили в ядрах нейронов кошки интенсивно окрашенные тельца, названные тельцами Барра. Они представляют собой неактивную Х-хромосому. Различают три возможных расположения полового хроматина в ядре: тесное соприкосновение его с ядрышком; свободное расположение в кариоплазме и контакт с ядерной ембраной.

Таким образом, у самок млекопитающих транскрипционно активна только одна Х-хромосома – это феномен компенсации дозы гена. Факультативный гетерохроматин обогащен повторами типа LINE, которые способствуют конденсации хроматина.

В ходе раннего развития самок млекопитающих обе Х-хромосомы активны. На предимплантационных стадиях развития эмбриона происходит инактивация Х-хромосомы, унаследованной от отца. Во время имплантации зародыша происходит реактивация и последующая инактивация случайно либо отцовской, либо материнской Х-хромосомы. Иногда наблюдается предпочтительная инактивация отцовской Х-хромосомы (у сумчатых). Процесс инактивации контролируется сложным локусом Х-хромосомы – центром инактивации Xiс. Данный локус содержит ген Xist (Х inactive specific transcript). Продуктом этого гена является некодирующая ядерная РНК размером 16 тн.

Ген Xist имеет 3 промотора – Р0, Р1 и Р2. Если транскрипция идет с прототоров Р1 или Р2 – образуется стабильный продукт размером 15 т.п.н., если с промотора Р0 – возникает нестабильный продукт. Переключение транскрипции с Ро на Р1/Р2 коррелирует с началом инактивации Х-хромосомы. В функционально активной Х-хромосоме ген Xist инактивирован за счет метилирования ЦГ-динуклеотидов в промоторе гена.

РНК гена Xist не способна переходить с одной Х-хромосомы на другую. РНК Xist присоединяет различные белки, образуя комплексы, которые распределяются вдоль всей Х-хромосомы, запуская ее инактивацию. Они, несомненно, принимают участие в установлении неактивного состояния, так как Х-хромосома, у которой отсутствует район гена Xist, никогда не инактивируется. Если же ген Xist искусственно перенести на аутосому, то она инактивируется.

В период инициации инактивации продукт гена Xist становится стабильным и распространяется вдоль по всей длине Х-хромосомы. Это подавляет транскрипцию генов и приводит к модификации гистонов. После отделения линии герминальных клеток в соматических клетках происходит гиперметилирование инактивируемой хромосомы; неактивное состояние становится необратимым и наследуется в ряду клеточных поколений. В линии герминальных клеток самок ДНК инактивированной Х-хромосомы остается неметилированной и впоследствии хромосома реактивируется незадолго до вхождения клеток в мейоз. В зрелых ооцитах обе Х-хромосомы активны.

Выбор того, какая Х-хромосома инактивируется, случаен, но это может регулироваться аллелями Xce (X-linced X controlling element). На линиях мышей было обнаружено три аллеля Хсе – "слабый" Xcea, "промежуточный" Xceb и "сильный" Xcec. В гетерозиготах наиболее часто инактивируются те Х-хромосомы, которые несут более слабый аллель. У гомозигот выбор происходит случайно. Xce локус расположен вблизи Xic. Предполагается, что Xce связывают транс-факторы, регулирующие работу генов в Xic, предопределяя выбор между Х-хромосомами.

Ряд генов неактивной Х-хромосомы ускользает от инактивации. Например, избегает инактивации район спаривания с Y-хромосомой. В данном локусе находятся гены, присутствующие и на Х- и на Y-хромосомах: то есть и у XY-самцов таких генов по паре, и у XX-самок их столько же — этим генам не нужна компенсация дозы.

Формирование гетерохроматина строго детерминировано и происходит на определенной стадии эмбрионального развития, когда начинается транскрипция на хромосомах развивающегося эмбриона. Формирование гетерохроматиновых доменов надежно защищает организм от экспрессии генетического материала, которая не нужна в соматических клетках.

Образование факультативного гетерохроматина – механизм регуляции активности генов. Пример – мозаичное проявление признаков, контролируемых сцепленными с полом генами у самок млекопитающих – кошки с черепаховой окраской (пятна черной и желтой шерсти); женщины, гетерозиготные по сцепленной с полом мутации эктодермальной дисплазии (на некоторых участках челюсти нет зубов; на теле чередуются участки кожи с наличием и отсутствием потовых желез).

Кариотип человека

Хромосома - это самовоспроизводящийся структурный элемент ядра клетки. Число, размер и форма хромосом строго определены и специфичны для каждого вида. Термин "хромосома" был предложен в 1888 W. Waldeyer. Каждая хромосома состоит из одной или нескольких пар хроматиновых нитей. Морфологию хромосом эукариот определяют на стадии метафазы митоза. Характерные для вида особенности хромосом (то есть их количество, размеры, форма, наличие спутников и т.д.) называют кариотипом.

При анализе кариотипа хромосомы располагают в виде идиограммы. Идиограмма – это систематизированный кариотип, т.е. хромосомы располагаются попарно по мере убывания их величины, с учётом положения центромеры, наличия вторичных перетяжек и спутников (рис. 6.5). Половые хромосомы выделяют особо. У человека длина хромосом составляет от 1,5 до 10 мкм.

В объеме интерфазного ядра каждое плечо хромосомы располагается в определенной зоне, объем которой не перекрывает объем соседних хромосом, хотя они примыкают друг к другу. Каждая из хромосом в нескольких местах связана с ядерной оболочкой. Все теломерные участки фиксированы на ядерной мембране на одном полюсе интерфазного ядра; на противоположном полюсе ядра располагаются (тоже фиксированные на мембране) центромерные районы хромосом.

Рисунок 6.5. Идиограмма хромосом человека

В последнее время показано, что в нормальных клетках богатые генами хромосомы располагаются ближе к центру ядра, а бедные генами хромосомы – на периферии ядра. Например, хромосом 18 и 19. Материал хромосомы 19, богатой генами, тяготеет к внутреннему компартменту ядра, тогда как территория хромосомы 18, бедной генами, находится на его периферии. Область, прилежащая к ядерной оболочке, и области, прилежащие к конститутивному (н-р, прицентромерному) гетерохроматину, являются в ядре неактивными компартментами. Простое перемещение генов в эти компартменты приводит к их долговременной инактивации. Пример: в эритроидных клетках глобиновые гены располагаются далеко от конститутивного гетерохроматина, тогда как в неэритроидных клетках они практически контактируют с конститутивным гетерохроматином.

Каждая хромосома имеет первичную перетяжку или центромеру, которая делит хромосому на два плеча (рис. 6.7.). Участок центромеры ответственен за контакт с микротрубочками веретена деления и перемещения хромосомы при клеточном делении. К центромерной ДНК присоединяются центромерные белки, образующие кинетохор. Это справедливо для хромосом с локализованной центромерой.

В центромерных районах хромосом локализована сателлитная ДНК, т.е. высоко повторяющиеся последовательности ДНК. Центромерная ДНК S. cerevisiae состоит из повторяющихся участков по 110 п.н. Она имеет по 2 консервативных участка (1 и 3) и центральный элемент (2), обогащённый АТ. У мыши – основной класс стДНК – повтор последовательности в 234 п.н.

ДНК центромерного участка хромосом человека представлена блоком тандемно организованных повторяющихся единиц размером 171 пн. Тяжи мономеров включают до 3 млн. пн. В середине тяжа идентичность копий мономеров составляет 99%, а на концах тяжа единицы мономеров более дивергированы. Характер организации центромер человека и арабидопсиса сходен, хотя первичные последовательности их мономеров совершенно различны.

В центромерном хроматине эукариот обнаружены видоспецифические варианты гистона Н3 – CENP-A у человека и CENH3 у растений. Предполагается, что именно CENH3, взаимодействуя другими гистонами Н2А, Н2В, Н4 формирует и определяет специфический тип нуклеосом, которые присутствуют только в функционирующих центромерах. Возможно, что такие нуклеосомы являются "якорями" для образования кинетохора.

В организации центромерного хроматина определенную роль могут играть малые РНК. Показано, что пул специфических для центромер малых РНК (40-200 пн) транскрибируется с центромерного ретротранспозона и сателлитной ДНК, связан с центромерным гистоном Н3 в пределах комплекса кинетохора кукурузы.

Сформированный кинетохор представляет собой трехслойную структуру: внутренний слой (40-60нм), светлоокрашенный средний слой (25-30 нм) и внешний слой (40-60 нм). Внутренняя поверхность кинетохора взаимодействует с центромерным хроматином. Микротрубочки, связанные с кинетохором, контактируют с его внешним слоем.

В зависимости от расположения центромеры выделяют метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы. Для акроцентрических хромосом характерно наличие вторичной перетяжки, отделяющей спутники. Данный участок хромосомы содержит большое количество генов рРНК. Гены рРНК часто образуют тандемные пары, которые организованы в кластеры. Каждый кластер тандемно повторяющихся генов рРНК соответствует ядрышковому организатору.

Теломеры – концевые структуры линейных хромосом, состоящие из повторяющихся последовательностей ДНК. У человека теломерные участки хромосом образованы тысячами повторов последовательности TTAGGG. Среди растений наиболее часто в теломерах повторяется последовательность TTTAGGG. Известно, что растения семейства луковичных имеют иные теломерные последовательности. Теломерные последовательности у Sacharomyces cerevisia представляют собой вариабельные повторы TG. У дрожжей теломера находится в ненуклеосомном хроматине, защищённом от действия нуклеаз, и называется телосомой.

Теломерные районы хромосом имеют общие с гетерохроматином свойства, в том числе: наличие высокоповторяющихся последовательностей, способность образовывать ассоциаты, инактивация генов, попавших в зону гетерохроматина или теломерного хроматина.

Теломеры хромосом собраны в несколько кластеров, которые располагаются по периферии ядра. Предполагают, что теломерные последовательности заякориваются на ядерной оболочке с помощью ДНК-белковых взаимодействий. Кроме того, теломеры взаимодействуют друг с другом. При этом плечи хромосом никогда не переплетаются. Ещё в 30-е годы Барбара Мак-Клинток показала, что теломеры защищают хромосомы от деградации и препятствуют слипанию хромосом.

Сейчас известно, что в результате "концевой недорепликации" в 3-нити молекулы ДНК образуется одноцепочечный конец, который специфическим образом сворачивается и взаимодействует с двунитевым районом теломеры, образую Т-петлю. Т-петля стабилизируется белковыми факторами. Этот процесс обеспечивает защиту молекулы ДНК от экзонуклеаз и называется кэппингом. Нарушение кэппинга может приводить к теломерным слияниям плеч хромосом. Нарушение кэппинга теломер распознается как разрыв, который должен репарироваться. Это приводит к теломера-теломерному слипанию хромосом с образованием дицентриков.

Специфические элементы теломер необходимы для расхождения сестринских хроматид в митозе. На Tetrachymena показано, что введение мутации в последовательность теломерного повтора блокирует расхождение хроматид в анафазе митоза. Предполагают, что теломеры сестринских хроматид соединены друг с другом на протяжении G2 – фазы клеточного цикла и в митозе до метафазы включительно. Ассоциаты теломер создаются с помощью теломерсвязывающих белков. В норме ассоциаты теломер должны распадаться перед расхождением хроматид в анафазе. Возможно, что при мутации в теломерной ДНК изменяется узнавание теломерного комплекса топоизомеразой 2. Этот фермент необходим для разделения хромосом в анафазе.

Теломеры необходимы для начала репликации ДНК: к ним прикрепляется РНК-затравка, с которой на каждой из нитей двойной спирали ДНК начинается синтез нити, комплементарной первой. После каждого деления клетки часть концевых нуклеотидов на каждой из вновь образованных хромосом безвозвратно теряется вместе с РНК-затравкой. При каждом цикле репликации дочерняя цепь ДНК теряет часть повторов теломеры -8-16 нуклеотидов. Предполагают, что как только теломеры укорачиваются ниже некой критической длины, происходит остановка клеточного цикла и старение клетки. Предложена модель старения, которая основывается на том, что гены, расположенные рядом с теломерой, подвергаются нестабильной транскрипционной репрессии. Предполагают, что транскрипция локуса "AGE" также подавлена благодаря теломерному эффекту положения. По мере старения клеток и укорочения теломер эта репрессия снимается и данный локус становится транскрипционно активным.

Наличие постоянно делящихся клеток у животных, тотипотентность растительных клеток предполагает, что они должны либо поддерживать, либо синтезировать полный комплемент теломерных повторов. В 1971 году Оловников предположил существование особого механизма, предотвращающего недорепликацию линейных молекул ДНК прежде всего в половых и раковых клетках, в тоже время данный механизм не действует в большинстве соматических клетках.

Грэйдер и Блэкберн на Tetrachymena впервые <

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: